Ich stelle ein Projekt vor, das ich mit meiner Diplomandin zusammen bearbeitet habe und das gerade online in Forensic Science International (s.u.) veröffentlicht wurde.
Über die Grundlagen zum Plötzlichen Kindstod (SIDS) und zur Micro-RNA könnten sich geneigte aber bei diesen beiden Themen nicht (mehr) ganz sattelfeste LeserInnen in den verlinkten Artikeln informieren. Unser Forschungsansatz ist tatsächlich sehr innovativ, da wir bisher weltweit die ersten sind, die an Micro-RNA (miRNA)-Dysregulation beim Plötzlichen Kindstod arbeiten.
RNA im Allgemeinen und Micro-RNA im Speziellen sind seit meiner Zeit in der Krebsforschung in hohem Maße Ziele meiner wissenschaftlichen Neugier. Ich hatte damals als erster Micro-RNA-Analysen an primären ZNS-Lymphomen durchgeführt und war von diesen kleinen regulativen Molekülen so fasziniert, daß ich sie in die Forensik „mitgenommen“ habe, wo sie bis vor kurzem überhaupt keine Rolle spielten und vielen gänzlich unbekannt waren. Inzwischen erforschen weltweit einige Gruppen und in Deutschland, gefördert von der DFG, bislang nur wir die Möglichkeiten forensischer miRNA-Analytik.
Durch die Arbeit in der forensischen Genetik bekam ich es dann auch mit der Forschung zu SIDS zu tun und wir haben inzwischen auch einige Arbeiten zu verschiedenen Genorten (z.B. MAO-A) vorgelegt, die in bestimmten Varianten möglicher- bzw. unwahrscheinlicherweise zur Entstehung von SIDS beitragen.
Da die Rolle der miRNAs bei der Pathogenese zahlreicher Krankheiten, wie Krebs und verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen bereits gut belegt ist, begann ich, mich zu fragen, ob die Dysregulation, also die fehlerhafte Regulierung von miRNAs und die dadurch bedingten Auswirkungen in den Zellen und Geweben eines Organismus nicht auch einen Einfluss auf den Pathomechanismus zumindest einer Untergruppe von SIDS-Fällen haben könnte.
So entschlossen wir uns, diese Frage im Rahmen einer Pilotstudie von zunächst noch begrenztem Umfang zu untersuchen. Gleichzeitig wollten wir prüfen, ob sich eine verlässliche miRNA-Analyse auch an Gewebeproben würde durchführen lassen, die zuvor mit Formalin fixiert und in Paraffinwachs eingebettet (FFPE) worden waren. Dieser Fixierungs- und Archivierungsprozess konserviert zwar die Gewebe sehr gut und ermöglicht jahrelange Lagerung und schöne histologische Färbungen, ist aber bekanntermaßen sehr „ungesund“ für alle Nukleinsäuren, besonders für die empfindliche RNA, die dabei häufig jenseits der Analysierbarkeit zerstört wird.
Wir stellten also zwei Kollektive aus jeweils zwischen 20 und 30 SIDS- und Kontroll-Proben (von verstorbenen Kindern, bei denen SIDS ausgeschlossen werden konnte) zusammen. Eines bestand aus frischen Proben von Herzgewebe, das direkt nach der Entnahme in RNA-konservierende Lösung überführt und tiefgefroren worden war. Das andere Kollektiv umfasste Proben von Hirnstammgewebe, die FFPE-konserviert worden und zum Teil schon einige Jahre alt waren. Wir wählten Gewebeproben von Herz und Hirnstamm, da es aktuelle und gut belegte Hypothesen sowohl für die Beteiligung von Herzarrhythmien als auch dysfunktionalen Regulationsprozessen im Hirnstamm bei der Entstehung von SIDS bei jeweils einer Untergruppe von Fällen gibt.
Dann selektierten wir unter bestimmten Suchkriterien vielversprechende miRNA-Kandidaten aus der miRBase (einer speziellen miRNA-Datenbank). Wir suchten nach miRNAs, die möglichst spezifisch in Herz- bzw. Hirngewebe exprimiert werden und für die bereits die Beteiligung an pathogenen Vorgängen in diesen beiden Organen nachgewiesen wurde. Für Herz- und Hirngewebe wählten wir jeweils zwei miRNA-Kandidaten aus: miR-1 und miR-133 für Herz und miR-124a und let-7b für Hirn. Da wir die differentielle Expression der miRNAs mittels der Technik der sondenbasierten Reverse-Transkriptions quantitativen PCR (RT-qPCR, ein kompliziertes Verfahren, das hier ein wenig näher beschrieben wird) untersuchen wollten, benötigten wir zudem noch zwei weitere RNAs (aber keine miRNAs), die als Grundlage für die Normalisierung unserer Daten dienten: die kleinen, Nucleolus-RNAs, sogenannte snoRNAs, U18 und U47.
Anschließend führten wir die Laborarbeiten durch, d.h. Extraktion, Konzentrations- und Qualitätsbestimmung von total-RNA (also der gesamten, auch die miRNA enthaltenden RNA aus den Gewebeproben), spezifische stemloopprimerbasierte Reverse Transkription in cDNA (die Umschreibung der uns interessierenden miRNAs in ein DNA-Format) und schließlich die snoRNA-normalisierte RT-qPCR (die nur mit DNA funktioniert, weshalb die Umschreibung vorher nötig war) zur Messung des Expressionsniveaus der miRNAs in den SIDS- und Kontrollproben, gefolgt von softwaregestützter Messdatenauswertung und statistischer Bewertung.
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