Heute erscheint die aktuelle Ausgabe der Zeitschrift BIOspektrum (Springer Verlag) mit einem Special zu PCR/qPCR. Für dieses Special habe ich einen Artikel geschrieben, der exclusiv für die Leser von blooD’N’Acid auch hier zu lesen ist :-)  (Als hilfreich für die Lektüre könnten sich die vorhergehenden Beiträge zu PCR, DNA-Quantifizierung und STR-Multiplex-PCR erweisen. )

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Der Einzug der Untersuchung von Nukleinsäuremolekülen in die forensischen Wissenschaften hat sich seit den 1980er Jahren als großer Erfolg und unersetzliche Bereicherung für Rechtsprechung und Rechtspflege erwiesen und bildet bis heute das Hauptbetätigungsfeld der forensischen Molekularbiologie [1]. Eine besonders wichtige Aufgabe unserer Disziplin besteht in der Erstellung von DNA-Profilen. Ein DNA-Profil ist eine Auflistung genetischer Merkmale, die in ihrer Kombination individualspezifisch, d.h. einzigartig für die Person sind, von der die DNA stammt. Man verwendet solche Profile, um unkenntliche Leichen zu identifizieren, einen Täter der Beteiligung an einem Verbrechen zu überführen oder um ein biologisches Abstammungsverhältnis zwischen zwei Personen, etwa eine Vaterschaft, nachzuweisen.

Aber auch bei der RNA-basierten Interpretation von komplizierten Spurenmustern, wie sie häufig an Tatorten von Verbrechen vorgefunden werden, kann die forensische Molekularbiologie einen entscheidenden Beitrag leisten [2]. Indem sie durch die Identifikation der vorhandenen Spurenarten und die Aufschlüsselung komplexer Mischspuren die Interpretation des Spurenbildes und seiner Entstehung ermöglicht, kann eine auf objektiven Belegen begründete Rekonstruktion des Tathergangs erfolgen.

Zur Erfüllung aller dieser Aufgaben sind die Polymerasekettenreaktion (PCR) und verschiedene spezialisierte Abwandlungen dieses Verfahrens von zentraler Bedeutung und die PCR ist aus der modernen Forensik nicht mehr wegzudenken.

 Quantitative PCR zur Bestimmung der Menge und Reinheit von Spuren-DNA

Die Analyse biologischer Spuren von Tatorten stellt für forensische Biologen häufig eine Herausforderung dar. Nicht selten bestehen solche Spuren aus nur einem einzelnen telogenen Haar oder einigen wenigen Hautschuppen, die ein Täter hinterlassen hat. Zum sehr geringen DNA-Gehalt solcher Spuren kommt noch erschwerend hinzu, daß die DNA darin durch Umwelteinflüsse wie Feuchtigkeit oder UV-Strahlung beschädigt und/oder durch Stoffe aus der Umgebung (Inhibitoren) verunreinigt sein kann. Sowohl beschädigte als auch mit Inhibitoren verunreinigte DNA kann in schwer oder nicht interpretierbaren DNA-Profilen resultieren. Aus diesem Grund muß vor der eigentlichen DNA-Profilerstellung die Integrität, Menge und mögliche Verunreinigung der aus den Spuren extrahierten DNA analysiert werden. Hierzu eignet sich besonders gut ein quantitatives PCR-Verfahren. Während der zyklenweise Ablauf der Standard-PCR wie eine „black box“ ist, in die man nicht hineinsehen kann und an deren Ende man lediglich eine bestimmte Menge des gewünschten Produktes erhält, ermöglicht die quantitative PCR (qPCR) [3] eine fluoreszenzbasierte exakte Messung des Zuwachses des PCR-Produktes in jedem Zyklus der PCR.

Zusätzlich zu den für die PCR üblichen Primern benötigt dieses Verfahren dafür sogenannte Sonden: kurze Nukleotidsequenzen, die komplementär für genau den von den beiden Primern flankierten DNA-Abschnitt und zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. In der Annealingphase der qPCR lagern sich nicht nur die Primer sondern auch diese fluoreszenzmarkierten Sonden an ihre jeweilige Zielsequenz an. Wenn dann die DNA-Polymerase, die am 3’-Ende jedes Primers ansetzt, um eine Kopie des Gegenstrangs zu erzeugen, in ihrem Fortschreiten auf die Sonde trifft, verdrängt sie die Sonde von ihrer Bindestelle und zerstört sie dabei. Hierdurch wird der in der intakten Sonde inaktivierte Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und durch einen im qPCR-Gerät verbauten Laser zum Leuchten angeregt, was von einem Sensor detektiert wird. Es wird dabei pro PCR-Zyklus desto mehr Farbstoff freigesetzt, je mehr Sonden binden und zerstört werden können. Die kontinuierlich ansteigende Fluoreszenzsignalstärke, die somit direkt mit dem Zuwachs an PCR-Produkt korreliert ist und in jedem Zyklus erneut gemessen wird, ermöglicht in der Folge einen genauen Rückschluss auf die Ausgangskonzentration der DNA zu Beginn der qPCR. So läßt sich also bestimmen, wie viel DNA aus dem Spurenmaterial gewonnen wurde und ob es ausreichend für nachfolgende Untersuchungen ist.

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Kommentare (5)

  1. #1 Bloody Mary
    27/03/2013

    Du arbeitest ja viel schneller (und wesentlich mehr), als ich lesen kann!

    Auch inhaltlich beeindruckend. Wieder mal.

    • #2 Cornelius Courts
      27/03/2013

      Vielen Dank.
      In diesem Fall hätte ich allerdings vielleicht etwas langsamer machen sollen, denn ich habe doch glatt vergessen, die Bilder
      einzubauen. :-( Sorry! Wird heute Abend nachgeholt, versprochen!

      Zu den Links: die im Moment im Beitrag gesetzten Links funktionieren nicht. Das ist ein neues, extrem nerviges Problem der SB-Blog-Software, die Links aus zeiten vor der WP-Umstellung nicht mehr richtig weiterleitet.
      Bitte einfach die Endung “.php” entfernen, dann funktionieren die Links.

      Bin mal gespannt, ob hier gleich jemand, der nichtmal meinen Namen richtig schreiben kann, statt zum Artikel selbst seine Sekrete zu irgendwelchen Quisquilien verschmieren wird. Wenn ja, werde ich diese Verunreinigungen entfernen.

  2. #3 bazille
    wien
    27/03/2013

    bitte entschuldigen Sie die Frage , ist ein wenig off topic
    Ich brauchte eine gute einführung in die QPCR Technik
    Haben sie eine empfehlung?

  3. #4 Cornelius Courts
    http://scienceblogs.de/bloodnacid
    27/03/2013

    @”Ich brauchte eine gute einführung in die QPCR Technik
    Haben sie eine empfehlung?”

    Das kommt auf Ihr Vorwissen und Ihre Sprachkenntnis an. Zur qPCR gibt es inzwischen wirklich Unmengen an Literatur. Eine grobe Einführung auf Deutsch findet sich im Wiki-Eintrag, der gar nicht so schlecht ist (http://de.wikipedia.org/wiki/Real_Time_Quantitative_PCR).
    Ich habe in diesem Beitrag (http://www.scienceblogs.de/bloodnacid/2011/04/forensische-genetik-dnaquantifizierung) auch ein wenig zur qPCR geschrieben.
    Auf Deutsch gibt es meines Wissens (noch) kein eigenes Buch zur qPCR. Sehr wahrscheinlich werden Sie aber in den diversen Büchern zur PCR zumindest ein Kapitel darüber finden.
    Ansonsten bieten diverse Lehrinstitute (z.B. MTA- oder Berufsschulen) häufig Kurse in qPCR an. Diese sind häufig recht teuer, dafür kann man die qPCR im Labor ausprobieren.

    Wenn Englisch auch ok ist, dann gibt es einen Gold-Standard vom “qPCR-Papst”, das ist dieses Buch: “A-Z of Quantitative PCR” von S. Bustin. Ein anderer massiver Wälzer wäre “Quantitative Real-Time PCR in Applied Microbiology” von Martin Filion. Handlicher und günstiger ist “Real-time PCR” von Dorak.
    Ich hoffe, es ist etwas für Sie dabei.

  4. #5 bazille
    wien
    28/03/2013

    Hallo
    vielen Dank, nun vorkenntnis ist gegeben, aber als ich noch auf der Uni war , waren die Geräte so teuer das man einen Diplomanten nicht ran lies 😉
    Ich brauchs beruflich , Quantitative Real-Time PCR in Applied Microbiology scheint passenden zu sein. Vielen Dank nochmal