In der Biologie oder Medizin gibt es manchmal Fragestellungen bei denen man seine Probe für das Mikroskop erst vorbereiten muss. Wenn zum Beispiel herausgefunden werden soll, in welchem Bereich einer Zelle sich ein bestimmtes Eiweiß aufhält, dann sollte man sowohl das Eiweiß irgendwie markieren als auch den Bereich. Zellen sehen eben immer anders aus, man kann leider nicht sagen, dass der Golgi-Apparat* immer links vom Zellkern sitzt. Das Ding, mit dem seltsam klingenden Namen, der Golgi-Apparat, ist ein Orgänchen (in schlau: Organelle) einer Zelle und sorgt unter anderem für die Sekrettbildung und einige andere Funktionen des Stoffwechsels. Solche Orgänchen oder Organellen kann man vielleicht noch mit einem Phasenkontrastmikroskop erkennen, oder ganz sicher mit den Elektronenmikroskopen am RKI, aber einzelne Eiweiße zu erkennen kann man mit diesen Methoden** vergessen.

grüne Quallen und organische Chemie

Um in einer Zelle etwas zu markieren gibt es mehrere Möglichkeiten. Die meisten davon haben mit Fluoreszenz zu tun, also mit dem “Zurückleuchten” von bestimmten Farbstoffen, wenn man sie mit Licht bestrahlt. Zellen können gentechnisch verändert werden, so das sie ein bestimmtes Eiweiß etwas anders herstellen, nämlich mit einem kleinen Anhängsel, dass Fluoreszenz zeigt. Diese Dinger heißen fluoreszente Proteine, sind also auch Eiweiße und kommen in diversen Lebensarten vor. Für das grüne fluoreszierende Protein (GFP) aus einer bestimmten Quallenart gab es 2008 den Chemienobelpreis für Martin Chalfie, Osamu Shimomura und Rager Y. Tsien. Vielleicht wundert man sich jetzt, dass man der Zelle einfach sagen kann, dass da an ein bestimmtes Eiweiß noch was leuchtendes dran gebastelt werden soll. Das muss doch irgendwie stören! Durchaus eine begründete Sorge. Manchmal sitzt dieses leuchtende Anhängsel an einer blöden Stelle, und das Eiweiß kann nicht mehr das tun, wozu es gedacht war. Manchmal mag das fluoreszierende Protein ungerne alleine sein, und sucht sich immer einen Kollegen, was dann zu einem Klumpen führt, und man auch nicht mehr von “Die Zelle funktioniert noch wie vorher.” sprechen kann. Aber das kommt gar nicht so oft vor, wie man denkt. Diese fluoreszenten Proteine sind klein, in den meisten Fällen höchstens ein Zehntel der Größe des Eiweißes an dem sie hängen.

Eine andere Möglichkeit etwas zu markieren wären Fluoreszenz-Farbstoffe oder genauer: fluoreszierende, organische Farbstoffe. Das Wörtchen “organisch” heißt dabei nicht, dass es “natürliche” Farbstoffe sind, sondern, dass sie ihren Ursprung in der organischen Chemie*** haben. Im Fall dieser Farbstoffe kann man der Zelle leider nicht beibringen, diese selbst her zu stellen. Man muss sie von außen irgendwie in die Zelle hinein bekommen. Es gib noch mehr Möglichkeiten in einer Zelle etwas bunt zu machen, aber so Dinge wie Nanodots werde ich später gesondert behandeln.

Zellen...

Fluoreszenzbild von Zellen, markiert durch organische Farbstoffe, mit niedriger Vergrößerung. Der Zellkern in blau, Zellskelett (Mikrotubuli) in rot und Transportcontainer (Vesikel) in grün. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Die organischen Farbstoffe, die auch ich bei meiner Arbeit benutze, markieren durch Antikörper bestimmte Strukturen in der Zelle. Was für ein besonderes Eiweiß ein Antikörper ist, und wie dieses Y-förmige Ding ganz spezifisch Eiweiße in einer Zelle erkennen kann, ist eine Geschichte für sich. Für heute reicht es zu wissen, dass Antikörper nichts weiter als Eiweiße sind, die sehr genau ein anderes Protein erkennen können und dann daran binden. Um fluoreszierende organische Farbstoff in die Zelle hinein zu bringen, habe ich also meine Farbstoffe an Antikörper gebunden. Leider kommen diese markierten Antikörper nicht durch die Zellwand hindurch. Wenn man Zellen mit Antikörper markiert, dann müssen die Zellen vorher fixieren werden und kleine Löcher in die Zellwand gerissen werden. Fixieren sorgt dafür, dass die Zelle auf einen schlag getötet wird und alles in dem Moment des Todes einfriert und miteinander verklebt wird. So kann man sich eine Momentaufnahme der Zelle genau anschauen. Die Löcher in die Zellwand werden mit Tensiden gemacht – eigentlich nichts weiter als Seife oder Spüli. Die Zellwand besteht aus einer doppelten Lage von Lipiden, also Fett oder Fettsäuren, und mit ein ganz klein wenig Seife kann man dafür sorgen, dass Löcher entstehen, so das die Antikörper ins innere der fixierten Zelle vordringen können.

Warum ist Fluoreszenz so toll?

Im Artikel über den Brain Prize für das Zwei-Photonen-Mikroskop hab ich Fluoreszenz schon kurz angesprochen. Jetzt wird es Zeit genauer zu werden. Bei den Fluoreszierenden Proteinen und den organischen Farbstoffen ist das Prinzip des Zurückleuchtens gleich. In der Molekülstruktur gibt es irgendwo ein Elektron, dass nicht mehr viel Energie braucht um in einen angeregten Zustand angehoben zu werden. Und mit “nicht mehr viel Energie” meine ich genau so viel, dass ein Licht-Photon dafür ausreicht. Aus dem täglichen Leben kennen wir so etwas in der Regel nicht, so gut wie alles was wir sehen können absorbiert lediglich das Licht, beziehungsweise Reflektiert es. Aber auf die leuchtenden Notausgangschilder und Feuerwehrhelme gehe ich auch gleich ein, falls dem ein oder anderen jetzt schon ein “aber” auf den Lippen liegt.

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Kommentare (7)

  1. […] das wäre Phosphoreszenz. Auf die genauen Unterschiede werde ich in einem späteren Blogpost (hier) eingehen, bei dem ich mich mit den verschiedenen, leuchtenden Farbstoffen der Mikroskopie […]

  2. #2 werner
    4. April 2015

    “*** organische Chemie einfach erklärt: Alles wo viel Kohlenstoff drin vorkommt.”
    Fehlt noch “…und Wasserstoff”. So ein Diamant ist mitnichten organisch 😉

    • #3 André Lampe
      8. April 2015

      Ja, da hast du vollkommen recht.

  3. #4 Ludger
    5. April 2015

    Hat man die richtige Färbemethode, bekommt man auch ein ordentliches Ergebnis. Das war schon bei Robert Koch so. Damals waren es Anilinfarben (Fuchsin, Gentianaviolett und andere), die Arbeitsschritte 1.) färben, 2.) entfärben und 3.) gegenfärben. Der entscheidende Schritt bei der Entdeckung war die Entfärbung mit Salzsäure/Alkohol. Herausgekommen ist ein Vorläufer der Ziehl-Neelsen-Färbung und der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 1905.
    Ich habe zu diesem Post etwas bei Wikipedia nachgeschaut und im Zusammenhang mit den Säurefesten Bakterien auch noch eine interessante Fluoreszenz-Färbemethode gefunden:
    http://de.wikipedia.org/wiki/Auramin-Rhodamin-F%C3%A4rbung

    • #5 André Lampe
      8. April 2015

      Hallo Ludger,

      Ich muss gestehen, dass ich fast immer mit Antikörpern meine Farbstoff in eine Zelle gebracht habe. Das es eine eigene Färbemethode gibt, die die Bindungseigenschaften der Farbstoff selbst benutzt, wusste ich nicht (von DAPI mal abgesehen). Danke für den Hinweis. Ich muss wohl mal was zu den verschiedenen Eigenschaften von Fluoreszenz-Farbstoffen schreiben. Da wird auch sicher der Hinweis auf diese Rhodamine drin vorkommen.

  4. #6 Ludger
    5. April 2015

    Hallo André!
    Der Spamfilter ist m.E. zu streng eingestellt und blockiert erst mal alles. Das hemmt natürlich den Gedankenaustausch massiv.
    LG Ludger

    • #7 André Lampe
      8. April 2015

      Hallo Ludger!

      Danke für den Hinweis. Irgendwas funktioniert nicht mit den Voreinstellung – hab auch keine eMails mehr bekommen, dass da Kommentare warten. Ich gelobe Besserung!