In der Forschung bringt ein vergrößertes Bild einer Zelle die Wissenschaftler nicht wirklich weiter, jedenfalls in den meisten Fällen. Das grundsätzliche Aussehen von Zellen ist bekannt, man möchte vielmehr genauer verstehen wie die Prozesse in einer Zelle ablaufen. Dafür muss man sich anschauen was die verschiedenen Eiweiße in einer Zelle genau tun und wo sie sich befinden. Leider kann man nicht einfach dabei zusehen und so etwas über alle Eiweiße gleichzeitig lernen, Eiweiße sind viel zu klein um sie zu sehen oder bilden Strukturen mit so geringem Kontrast das auch die Phasenkontrastmikroskopie nicht weiterhelfen kann. Und genau dafür gibt es Farbstoffe, über die ich in Das bringt Farbe ins Leben schon ein wenig geschrieben habe.

Das Problem mit der Farb-Kamera

Ich glaube das überraschenste an einem Fluoreszenzmikroskop ist die Verwendung einer schwarz-weiß Kamera. Dieses Mikroskop, dass so wundervolle, farbenfrohe Bilder liefert, ist eigentlich farbenblind. Damit man verstehen kann warum gerade das extrem wichtig ist, müssen wir uns kurz mit Farben auseinander setzen. Hierbei geht es dann allerdings nicht um die Farbwahrnehmung des Menschen, die ohne Frage auch spannend ist, sondern um die Technik in digitalen Kameras.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von SH-SY5Y Zellen, in blau der Zellkern, in grün Clathrin-bedeckte Vesikel und in rot Mikrotubuli.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von SH-SY5Y Zellen, in blau der Zellkern, in grün Clathrin-bedeckte Vesikel und in rot Mikrotubuli. Anklicken für große Version (1776×1760 Pixel). (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Damit eine Digitalkamera Farben detektieren kann, besitzt sie verschiedene Detektoren, meistens für rotes, grünes und blaues Licht. Die Mischung dieser Farben sorgt dann später wieder dafür, dass wir am Bildschirm den Eindruck von vielen Millionen Farben haben, und um Fotos zu machen ist das auch vollkommen ausreichend. In der Mikroskopie möchte man aber nicht nur schöne Bilder machen sondern auch nachprüfbare Aussagen treffen, zum Beispiel wie unter diesen oder jenen Umständen das Eiweiß A im Verhältnis zu Eiweiß B in der Zelle vorkommt.

Markiere ich jetzt Eiweiß A mit einem roten Farbstoff und Eiweiß B mit einem grünen Farbstoff, hätte ich bei einer Farb-Kamera trotzdem ein Problem. Die Farbstoffe sind nämlich nicht rot oder grün sondern decken einen bestimmten Bereich des sichtbaren Spektrums ab. Das kann man hervorragend bei dem Graphen sehen, den ich schon im Artikel Das bringt Farbe ins Leben benutzt habe.

spektrum...

Spektrum eines Farbstoffs der in grün (568 nm) angeregt werden kann. Grüner Bereich: Wellenlängen die anregen können, oranger Bereich: Wellenlängen die ausgesendet werden können. Der grüne Strich zeigt eine Anregung durch einen Laser mit einer ganz bestimmten Wellenlänge. In rot ist der Filter dargestellt, der das Anregungslicht blockt, aber das meiste Fluoreszenzlicht durch lässt. Erstellt mit Semrock Searchlight.

Am unteren Rand des Graphen, an der x-Achse sieht man einen Regenbogen, der darstellen soll welche Farbe welcher Wellenlänge des Spektrums entspricht. Man sieht das der Farbstoff Alexa Fluor 568 schon im gelb-grünen Bereich Photonen aussenden kann, und das sein Emissionsspektrum sich weit bis in den roten Bereich hinein zieht. Würde man die Sensitivitäts-Kurven einer digitalen Farbkamera hier einzeichnen, würden sich die Bereich für grün und rot dieser Kamera überlappen, und zwar an der Stelle, bei der der Farbstoff Alexa Fluor 568 von oben, schon sehr viele Photonen abgibt, nämlich bei 588nm. Das heißt also, dass eine Farb-Kamera diesen roten Farbstoff als eine Mischung aus rot und grün detektieren würde. Man könnte jetzt meinen, dass man das Problem umgehen kann, wenn man einen roten Farbstoff und einen blauen Farbstoff benutzt, aber auch da muss ich leider enttäuschen. Sowohl ein blauer Farbstoff als auch ein roter Farbstoff würden auf einer Farb-Kamera Grünanteile aufweisen.

Wie macht man aus schwarz-weiß Farbe?

Die enttäuschende Antwort: überhaupt nicht. Bei einem Fluoreszenzmikroskop macht man für jede Farbe ein einzelnes Bild. Das geht auch kaum* anders, schließlich muss man einen Farbstoff mit einer definierten Wellenlänge anregen, sonst sendet er kein Fluoreszenzlicht aus. Dieses Fluoreszenzlicht ist gegenüber dem Anregungslicht etwas rot-verschoben, wie man oben in dem Graphen sehen kann. Vor der schwarz-weiß Kamera sitzt dann ein optischer Filter, der eben nur dieses Fluoreszenzlicht auf die Kamera fallen lässt. Und da sowohl Kamera als auch Mikroskop von einem Computer gesteuert werden, sagt die Software beim speichern des Bildes, dass dieses eine Bild die Farbe XY hat. Wenn man mag kann man dieses Bild rot sein lassen, damit es zur wirklichen Farbe des Farbstoffs passt, aber das ist kein muss. In einigen Fällen ist es sogar sehr sinnvoll von den eigentlichen Farben der Farbstoffe abzuweichen. Einige meiner Kollegen sind rot-grün-Farbenblind, und die freuen sich immer besonders, wenn ich ein Mikroskopiebild zeige, auf dem die interessanten Strukturen in rot und grün dargestellt sind. Mittlerweile haben das auch einige wissenschaftliche Journale erkannt, und schreiben vor, dass man zum Beispiel magenta-grün Darstellungen wählen soll. Ich habe das mal beispielsweise für das Mirksokopiebild von oben gemacht.

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Kommentare (21)

  1. #1 Ludger
    7. Juli 2015

    Versuch eines Nichtphysikers:
    Die Farbe des Farbstoffs in Lösung kommt dadurch zustande, das die Frequenzen eines kontinuierlichen Spektrums zum Teil absorbiert und zum Teil reflektiert werden. Die Farbe das anregenden Lichtes wählt man so, dass die Lichtquanten eine passende Energie haben, um bestimmte Elektronen im Farbstoff anzuregen. Die Farbe der Fluoreszenz kommt durch die Energie der Quanten , die beim Rücksprung der angeregten Elektronen abgegeben wird. Die anregenden Quanten müssen immer eine höhere Energie d.h. kürzere Wellenlänge haben, als die Quanten der erwünschten Fluoreszenz.

    • #2 André Lampe
      7. Juli 2015

      Herzlichen Glückwunsch Ludger, nicht nur der erste Kommentar, sondern auch der Erste mit der richtigen Antwort. Die Farbe der Substanz komm dadurch zustande, dass der Farbstoff alle Farben, die in seinem Absorptionsbreich liegen, “wegnimmt” und der Rest vom Licht reflektiert wird. Ich lausche deinem Vorschlag für Dinge unter’m Mikroskop.

  2. #3 Christian Thiele
    Regensburg
    7. Juli 2015

    @André: Ein grünes Blatt ist für dich dann also rot und blau, weil es ja rotes und blaues Licht absorbiert? :-)

    Das mit den Farben in Mikroskopbildern mit mehreren Kanälen kann auch verwirren. So dachte ich lange, ein infrarot-naher Farbstoff wäre blau, weil das im Mikroskop so eingestellt war (Biologen halt 😉 )

    • #4 André Lampe
      7. Juli 2015

      Für einen Ingenieur, der LED-Beleuchtungen für Pflanzen baut und erforscht, wird sich, nach einigem herumbasteln mit roten und blauen LED, die Möglichkeit für ein Standpunktwechsel ergeben – was die Farbe von Blättern an geht. 😉
      Ich bin, forschungstechnisch, mit dem Anregungsteil von Mikroskopen aufgewachsen und habe mir am Computer immer nur schwarz-weiß Bilder angeschaut. Vielleicht kommt es auch daher, dass ich meistens Farbsotffe wie Alexa Fluor 647 oder Dyomics 678 benutzt habe, die im roten angeregt werden und deren Fluoreszenz man mit bloßem Auge fast nicht mehr sieht. Das waren für mich rote Farbstoffe, für die Biologen far-red, Infrarot … oder für dich halt blau. :-)

  3. #5 rolak
    7. Juli 2015

    StoffFarbe: Summe des Nichtabsorbierten
    AnregungsFarbe: Zur Absorption für für Fluoreszenz passend + evtl-vibronisches
    FluoreszenzFarbe also fast immer langwelliger

    Falls das der erste richtige Lösungsversuch sein sollte, kannst Du eine Freikarte nach Gusto verteilen…

    btw: In der Grafik braucht es den Sperrfilter offensichtlich nicht, da das Anregungslicht sich nicht nach oben traut 😉

    • #6 André Lampe
      7. Juli 2015

      Ja du hast recht mit dem Anregungslicht. In der Realität sieht das allerdings ganz anders aus. Das ist leider das beste Schaubild mit deutscher Beschriftung das ich finden konnte und es erklärt den Rest recht schön. Daher wollte ich mich nicht extra hinsetzen und ein eigenes Schaubild basteln – hier liegt noch so eine Doktorarbeit die geschrieben werden will… 😉

    • #7 rolak
      8. Juli 2015

      Hey, das war keine Beschwerde, ist auch nicht sehr verständnis-verhindernd – finde es nur ulkig, wenn in jahr(zehnt)elang genutzten Grafiken solch offensichtliche Klopse eingebaut sind.

  4. #8 Ludger
    7. Juli 2015

    André Lampe:
    “Ich lausche deinem Vorschlag für Dinge unter’m Mikroskop.”

    Danke für das Angebot! Darf’s auch was nicht fluoreszierendes sein? Ich würde gerne mal die Spitze einer Injektionskanüle sehen.

    • #9 André Lampe
      7. Juli 2015

      Die Spitze einer Injektionskanüle werde ich hinbekommen. Ist eine sehr gute Idee!

      Ich habe mir für diese Serie vorgenommen, dass ich ausschließlich relativ günstige Mikroskope benutze, so das jeder das zu Hause nachmachen könnte. Da meine ersten beiden Käufe eher… naja, so Mittel waren, habe ich bisher dazu noch keine Kaufempfehlung geschrieben. Ich suche noch etwas günstiges, dass ich ohne Bedenken (und ohne großen Bastelaufwandt) empfehlen kann. Daher: Etwas fluoreszierendes kann ich auf diese Art und Weise nicht machen. Aber erzähl doch mal, was du dir bei der Fluoreszenz wünschen würdest…? Neugierig bin ich da schon.

    • #10 rolak
      8. Juli 2015

      Spitze einer Injektionskanüle

      Da ist evtl innere Vorbereitung nötig, Ludger — bei einem Matenaer-Vortrag wurden die Spitzen von AkupunkturNadeln gezeigt, sortiert nach dem Titel des Talks (finde grad die Stelle nicht… warum zum Henker ist das www nicht nach meinen Wünschen mit einem flotten Index versehen?).

      btw: Glückwunsch!

  5. #11 Ludger
    7. Juli 2015

    Aber erzähl doch mal, was du dir bei der Fluoreszenz wünschen würdest…?

    Da kenne ich mich nicht so gut aus; das können die Pathologen besser. Ich finde es aber sehr spannend, wenn die Pathologen in einem vorläufigen Befund nur feststellen können, dass es sich um einen anaplastischen Tumor ( https://de.wikipedia.org/wiki/Anaplasie ) handelt und auf eine spätere immunhistochemische Untersuchung ( https://de.wikipedia.org/wiki/Immunhistochemie ) verweisen, mit der sie dann nachweisen, ob es sich um entartetes Gewebe aus dem äußeren oder dem mittleren Keimblatt handelt. So differenzieren sie dann zwischen Karzinom und Sarkom. Oder man findet einen metastatischen Lymphknoten und kennt den Primärtumor nicht. Dabei hilft die Immunhistochemie, den Primärtumor zu finden. Die Methode ist oft die Immunfluoreszenz. Vielleicht fragst Du mal im Pathologischen Institut nach. Ich glaube, dass mittlerweise die ganze Lymphomdiagnostik und Leukaemiediagnostik so läuft.

    • #12 André Lampe
      7. Juli 2015

      Hmmm, ein Anlass für einen kleinen Ausflug. Das werde ich im Hinterkopf behalten, könnte aber etwas dauern. Die Spitze der Kanüle gibt es dafür früher, versprochen.

  6. #13 werner
    7. Juli 2015

    Als typischer “Rot-Grün-Blinder” (zumindest teilweise, nicht absolut) finde ich die alternative Farbwahl mit Magenta mehr als unglücklich. Das sieht für mich fast wie das Blau aus und hat auch noch die selbe Helligkeit, so dass hier Teufel mit Beelzebub ausgetrieben wurde.
    Schöne Links zum Thema Farbenfehlsichtigkeit und was man im Computerzeitalter dagegen tun kann:
    http://www.daltonize.org

    • #14 André Lampe
      8. Juli 2015

      Hallo Werner,

      Du hast vollkommen recht, mit blau zusammen ist das total unglücklich. Tatsächlich sollte man magenta-grün als zwei-Farben-Variante wählen. Ich habe nochmal nachgeschaut, in den author-guidelines auf die ich mich aus dem Kopf bezogen habe. Blau hätte ich dann wohl besser durch gelb ersetzen sollen – danke für den Hinweis! Den Link werde ich mir zu Gemüte führen. Auch Danke dafür.

  7. #15 Christian Thiele
    8. Juli 2015

    Ist in dem Alexa 647 Nr. 4 im Bild eigentlich ein zusätzlicher Farbstoff, der es blau macht (zum Pipettieren, Unterscheiden usw.)?

    • #16 André Lampe
      8. Juli 2015

      Nein, leider nicht. Da fehlt einfach das rot, sonst sind alle Farben vertreten und das ergibt blau.

  8. #17 Christian Thiele
    8. Juli 2015

    #16 Okay, so einfach also.

    Zum Thema Fluoreszenz im Eigenbau: Da habe ich mal das hier gefunden (LED oder Laserpointer als Lichtquelle – nicht ohne Gefahr- aber gibt ja auch Leute die Tesla-Coil basteln 😉 ): http://post.queensu.ca/~chinsang/lab-protocols/gfp-stereoscope.html

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  12. […] bei der Bilddarstellung umgehen kann. Es gibt dabei um Fluoreszenzmikroskopie, über die ich hier schon geschrieben habe. Die Dinge in der Zelle, die man sich anschauen will, markiert man dabei mit […]