Wenn Wissenschaftler etwas machen, dann machen Sie es richtig. Zum Beispiel Zellen zerstören, um die DNS herauszubekommen. Davide Accardi, Doktorand aus Palermo, zeigt mir wie das geht.

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Man nehme: Ein Eppi (ein kleines Plastikröhrchen, das unten spitz zuläuft, benannt nach dem größten Hersteller, Eppendorf). Ganz wichtig in diesem Fall: Schraubverschluss. Das Modell fehlt im Bild.

Dort hinein fülle man die Zellen, gelöst in einem Tropfen Wasser und einigen Salzen. Das ganze sitzt unten in der Spitze des Eppis.

Darauf schüttet Davide ein grobkörniges, transparentes Pülverchen – Glaskügelchen, so genannte Beads, jedes einzelne einen halben Millimeter groß. Nicht zu viel, wichtig.

Und dann? Schütteln. Aber nicht einfach so, in der Hand. Viel zu schwach, zu langsam, zu unkontrolliert. Und genau das ist es, was mich jedes Mal wieder fasziniert: Wenn Wissenschaftler was machen, machen Sie es richtig. Oft haben sie dafür eine Maschine.

In diesem Fall eine Rüttel-und-Schüttel-Maschine, Modell Mini-Beadbeater 8. Also der Mini-Glaskügelchen-Schläger (oder Mixer). Der ist etwa so groß wie ein Retro-Toaster und genau wie dieser in eine Edelstahlhülle gepackt. Nicht so schön, aber funktionell. Star Wars-Fans fühlen sich vielleicht entfernt an die AT-AT erinnert (wenn man sich Beine dazu denkt).

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In den Kopf dieser Rüttelmaschine steckt Davide vier der Eppis. Dann schraubt er die zylindrischen Kappe drauf, damit alles schön fest und sicher sitzt. Dann die Zeitschaltuhr auf eine Minute stellen – und ich sehe sofort ein, warum die Eppis Schraubverschlüsse brauchen und die Kappe des Maschinenkopfes ebenfalls verschraubt wird.

Affenzahn, anders kann man es nicht beschreiben. Mit 2800 Rüttlern und Schüttlern pro Minute, also 46 pro Sekunde, schüttelt der Beadbeater das Glaskügelchen-Zellen-Wasser-Gemisch, vor und zurück. Das da auch nur eine Zelle intakt bleibt, ist schwer vorstellbar. Es gibt auch ein Modell mit 6100 Oszillationen pro Minute. Da dauert das ganze Hackwerk nur eine halbe Minute.

Aber: Zuerst dachte ich, es wären die Glaskugeln, die durch rein mechanische Kraft die Zellen zerquetschen. So leicht kann man sich täuschen. Denn dafür sind die Glaskugeln viel zu groß. Umgerechnet auf menschliche Verhältnisse wäre eine Kugel mehr als einhundert Meter groß (Bernhard, einer der Physiker hier, hat das schnell mal ausgerechnet). Das heißt, zwischen den Kugeln ist eine Menge Platz für die Zellen. Das wäre nicht sehr effektiv.

Das was die Zellen zerstört, sind vor allem die enormen Druckunterschiede, die durch die hin- und her geschleuderten Glaskugeln in der Flüssigkeit entstehen. Die Kugeln sind eine Art quirl, die das Wasser in alle Richtung reißt. Dabei entstehen so gewaltige Scherkräfte, die an den Zellen ziehen und drücken, dass es sie auseinander reißt. Diese Tortur übersteht keine Zelle. Manche werden natürlich auch einfach zerquetscht. man stelle sich nur vor: Eine Glaskugel so groß wie zwei Fußballfelder nebeneinander.

Aber wie trennt man dann die Zellinnereien aus dem Glaskugel-Gemisch? Um die DNS zu extrahieren, können wir die Kügelchen nicht gebrauchen.

Und wieder gibt es eine Lösung, die sehr typisch für Wissenschaft ist, wie ich finde. Einerseits gibt’s für alles eine Maschine, manchmal sehr aufwändig konstruiert. Andererseits sind manche Lösungen wiederum so … so … so einfach.

Ich dachte erst, zum Auftrennen braucht Davide erneut eine toll konstruierte andere Maschine oder einen durchdachten Prozess. Doch es ist viel einfacher. Er sticht mit einer zuvor erhitzten Nadel ein Loch in die Spitze der Eppis. Dann steckt er diese in ein zweites Eppi. Fertig ist ein Sieb für die Glaskugeln. Das Loch muss nur einfach kleiner sein als die Kügelchen.

Warum schwierig, wenn es auch einfach geht.

Zum Rausschleudern der Zellinnereien ist es dann wieder wie mit dem Schütteln. Handbetrieb ist zu schwach, zu langsam, zu ungenau. Dafür gibt’s eine Zentrifuge. Die schleudert das Plastikröhrchen-Duo mit (bitte festhalten) 2100 Umdrehungen pro Minute im Kreis und treibt die Zellflüssigkeit aus dem oberen Eppi durch das Loch in das untere Eppi.

Welche Kräfte bei dieser Karussellfahrt entstehen, das verdeutlicht eine der wichtigsten Regeln beim Zentrifugieren: “Die Zentrifuge muss immer gleichmäßig besetzt werden“. Das heißt: Einfach mal ein Röhrchen durchschleudern ist verboten – oder drei, oder fünf. Es muss ein zweites, ein viertes oder sechstes Eppi, auf der jeweils gegenüberliegenden Seite eingesetzt werden. (siehe Kommentar Alexander) Das Gewicht muss gleich verteilt werden, sonst entsteht eine Unwucht und die Fliehkräfte Zerschmettern die Zentrifuge.

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Man stelle sich ein Kettenkarussell vor, auf dem nur ein Elefant mitfährt und sonst niemand. Ohne ein Gegengewicht endet die Karussellfahrt irgendwann im Desaster.

Wahrscheinlich kennt jedes Labor die Geschichte eines Anfängers, der genau diesen Grundsatz vergessen hatte. Das ist natürlich auch eine Art von “Zerstören, aber richtig.

Dank an Bernhard und Sven für die Erklärungen über die Zerstörungskraft der Glaskügelchen und natürlich an Davide)

Bilder: Wikipedia, Biospec Products

Kommentare (12)

  1. #1 Tobias
    Oktober 8, 2009

    Um dein Arsenal an Möglichkeiten der Zelllyse noch ein bisschen zu erweitern:
    enzymatische Lyse (Lysozym bei Bakterien mit Zellwand, Zymolyase für Hefe), Lyse in detergenzienhaltigem Puffer, osmotische Lyse, sonifizieren, French Press, tiefgefrieren und Mörsern, Zellmühlen, die entweder tatsächlich wie Karussele funktioneren (planet mill), Zellmühlen mit einer grossen Stahlkugel in einer Metalkapsel,…
    noch was vergessen? bestimmt.

  2. #2 Marcus Anhäuser
    Oktober 8, 2009

    “French Press” hört sich, mhm, cool an (“viel versprechend”wäre der falsche Begriff), das mit der großen Stahlkugel ist auch nicht schlecht :-)

  3. #3 Tobias
    Oktober 8, 2009

    Bei der French press hast du eine Druckkammer mit deinen Zellen drin. Die lässt du dann durch ein kleines Ventil ab. Durch den plötzlichen Druckabfall platzen die Zellen. Die Lyse mit der Stahlkugel ist mechanisch.

    Prinzipiell ist das Problem immer das gleiche: Je nach Zellmenge brauchst du ein anderes Gerät und die Proteine an denen du interessiert bist sollten möglicherweise nativ bleiben bei gleichzeitig effizienter und schneller Lyse.

  4. #4 Marcus Anhäuser
    Oktober 8, 2009

    Eine Frage, die mir beim Schreiben einfiel: Warum werden eigentlich die ganzen Organellen, der Zellkern und die DNS nicht auch zerstört, bei all den Kräften? Oder doch, oder nicht?

  5. #5 Tobias
    Oktober 8, 2009

    Kommt auf die Methode an, und darauf was du brauchst (intakte Organellen, Ganze DNA, native Proteine, inakte Proteinkomplexe,…).

    Wenn du mit SDS-haltigem Puffer sonifizierst ist alles dentaturiert, incl. Proteine. Wenn du enzymatisch und/oder osmotisch lysierst ist alles noch intakt. Bei deiner Behandlung mit den Glaskügelchen scherst du sicher die DNA. Für die Isolierung von Organellen gibt es etablierte Lyse- und Aufreinigungsprotokolle.

  6. #6 sil
    Oktober 8, 2009

    SDS ist übrigens ein stinknormales Tensid, nichts besonderes. Ich war regelrecht enttäuscht, als ich mitbekam, was die Abkürzung bedeutet:
    sodium dodecylsulfate oder auch Natriumlaurylsulfat.
    http://hoax-info.tubit.tu-berlin.de/hoax/lauryl.shtml

    Damit kann man sich waschen. Ich habe sicher mehrere Gramm dieser Chemikalie im Bad zu Hause.

  7. #7 Tobias
    Oktober 8, 2009

    Ich wusste gar nicht, dass SDS seinen eigenen Hoax hat. Als Pulver ist es durchaus nicht ohne und führt sofort zu Atemreizungen.

    Im Labor wird SDS hauptsächlich bei der Protein-Gelelektrophorese genutzt (SDS-PAGE), bei der Proteine anhand ihrer Grösse (eigentlich: Ladung) entlang eines elektrischen Feldes über ein fenimaschiges Gel aufgetrennt werden.

  8. #8 rolak
    Oktober 8, 2009

    Man stelle sich ein Kettenkarussell vor, auf dem nur ein Elefant mitfährt und sonst niemand. Ohne ein Gegengewicht endet die Karussellfahrt irgendwann im Desaster.

    Ohne meckern zu wollen:
    a) ich kann mir das nicht so richtig vorstellen
    b) ich kann mir sehr wohl vorstellen, daß die Testfahrt mit einem zweiten Elefanten als Gegengewicht ebenfalls zu einer Katastrophe führt 😉

    Es dürfte doch so sein, daß jeder Fehler, der gemacht werden kann, in der Laborpraxis auch schon einen Vorführer gefunden hat. Selbst in dem eher kurzen und unaufwendigen Chemiepraktikum, das ich zur Physik absolvieren durfte, wurden nicht nur meinerseits interessante Fallstricke gefunden…

  9. #9 Alexander
    Oktober 8, 2009

    Regeln beim Zentrifugieren: “Die Zentrifuge muss immer gleichmäßig besetzt werden”. Das heißt: Einfach mal ein Röhrchen durchschleudern ist verboten – oder drei, oder fünf. Es muss ein zweites, ein viertes oder sechstes Eppi, auf der jeweils gegenüberliegenden Seite eingesetzt werden. Das Gewicht muss gleich verteilt werden, sonst entsteht eine Unwucht und die Fliehkräfte Zerschmettern die Zentrifuge.

    Tipp für die faulen Biologen: Man braucht gar kein Tara-Eppi! Auch ungerade Eppizahlen kann man so im Rotor unterbringen, dass das Gewicht ausgeglichen ist. Man muss sie einfach nur in zwei Portionen aufteilen, die für sich stabil aufteilbar sind, also bsp. 5=2+3. Problematisch wird es nur bei 1 und 11 Eppis im 12er Rotor 😉

  10. #10 Marcus Anhäuser
    Oktober 8, 2009

    @Alexander
    stimmt, habe ich nicht bedacht. Danke.

  11. #11 Marcus Anhäuser
    Oktober 8, 2009

    @rolak
    “a) ich kann mir das nicht so richtig vorstellen”

    Ich habe komischerweise gleich an Benjamin Blümchen gedacht und konnte mir das super vorstellen. Hab eben kleine Kinder. 😉

  12. #12 Andre Doberl
    Februar 2, 2011

    Hallo! ich bräuchte solche “EPiS”-Röhrchen!! beim bild sind 4 grössen abgebildet
    ich bräuchte die 2 kleinen…..!! wieviel kosten 100 Stk.??

    m.f.G. DOBERL / WiEN