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Update:

Warum kann man das Fluoreszenzlicht tief in der Probe sehen, wenn man doch eigentlich, mit dem Licht einer ähnlichen Wellenlänge, nicht so weit vordringen könnte?

Färbt man seine Probe mit fluoreszierenden Farbstoffen, wird man in so gut wie jeder Zelle Farbstoffe finden können, also auch in jeder Zelle die auf dem Weg zu dem Bereich liegen, der einen interessiert. Der Vorteil der Zwei-Photonen-Mikroskopie ist, dass nur im Fokuspunkt, dort wo man beobachten will, die Dichte der Photonen hoch genug ist, damit eine Anregung statt findet. Es entsteht also kein “störendes” Fluoreszenz-Licht an anderen Orten in der Probe. Das ist vergleichbar mit einem sehr nebligen Tagesanbruch. Wenn man mit einem Scheinwerfer versucht die Reflexion des Lichts auf einem weit entfernten Spiegel zu sehen, wird man, durch das am Nebel reflektierte Licht, so geblendet, dass vom Spiegel nichts zu sehen ist. Dabei ist wichtig, dass wir direkt vom Rand des Scheinwerfers schauen, und nicht unter einem Winkel.

Hinzu kommt, dass die Streuung von Licht mit kleinerer Wellenlänge zu nimmt. Langwelligeres Licht, wie der Anregungslaser eines Zwei-Photonen-Mikroskops, wird weniger stark gestreut und führt zu einem “gut” definierten Fokuspunkt. Mit Licht kürzerer Wellenlänge, wie bei einem normalen Fluoreszenzmikroskop, würde der Fokuspunkt verschmiert und zufällig verzerrt sein. Zwar ist das Fluoreszenzlicht, das zurück kommt, von dieser Streuung beeinflusst, aber es kommt aus einem wohl definierten Bereich. Dieses Signal reicht aus um ein Bild Punkt für Punkt zu rekonstruieren. Würde sowohl Hin- und Rückweg von der Streuung beeinflusst werden, würde sich der Abbildungsfehler durch Streuung so sehr aufsummieren, dass keine Details erkennbar sind. Nimmt man die Fluoreszenz von außerhalb des Fokuspunkt (siehe oben) mit hinzu, ist nichts mehr zu sehen.

Auch spielt eine Schädigung der noch lebenden Probe eine Rolle für die Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops. Nicht nur, dass Licht kurzer Wellenlänge Gewebe schädigen kann, angeregte Farbstoffe sind immer eine Schädigung. Wenn ein Farbstoff nicht “mehr kann” führt der Weg zum bleichen des Farbstoffs über einen Radikalzustand des Moleküls. Dies wird unter dem Begriff “Phototoxizität” zusammengefasst. Die Zwei-Photonen-Mikorksopie ist deutlich schonender, was diesen Aspekt an geht.