Update:

Warum kann man das Fluoreszenzlicht tief in der Probe sehen, wenn man doch eigentlich, mit dem Licht einer ähnlichen Wellenlänge, nicht so weit vordringen könnte?

Färbt man seine Probe mit fluoreszierenden Farbstoffen, wird man in so gut wie jeder Zelle Farbstoffe finden können, also auch in jeder Zelle die auf dem Weg zu dem Bereich liegen, der einen interessiert. Der Vorteil der Zwei-Photonen-Mikroskopie ist, dass nur im Fokuspunkt, dort wo man beobachten will, die Dichte der Photonen hoch genug ist, damit eine Anregung statt findet. Es entsteht also kein “störendes” Fluoreszenz-Licht an anderen Orten in der Probe. Das ist vergleichbar mit einem sehr nebligen Tagesanbruch. Wenn man mit einem Scheinwerfer versucht die Reflexion des Lichts auf einem weit entfernten Spiegel zu sehen, wird man, durch das am Nebel reflektierte Licht, so geblendet, dass vom Spiegel nichts zu sehen ist. Dabei ist wichtig, dass wir direkt vom Rand des Scheinwerfers schauen, und nicht unter einem Winkel.

Hinzu kommt, dass die Streuung von Licht mit kleinerer Wellenlänge zu nimmt. Langwelligeres Licht, wie der Anregungslaser eines Zwei-Photonen-Mikroskops, wird weniger stark gestreut und führt zu einem “gut” definierten Fokuspunkt. Mit Licht kürzerer Wellenlänge, wie bei einem normalen Fluoreszenzmikroskop, würde der Fokuspunkt verschmiert und zufällig verzerrt sein. Zwar ist das Fluoreszenzlicht, das zurück kommt, von dieser Streuung beeinflusst, aber es kommt aus einem wohl definierten Bereich. Dieses Signal reicht aus um ein Bild Punkt für Punkt zu rekonstruieren. Würde sowohl Hin- und Rückweg von der Streuung beeinflusst werden, würde sich der Abbildungsfehler durch Streuung so sehr aufsummieren, dass keine Details erkennbar sind. Nimmt man die Fluoreszenz von außerhalb des Fokuspunkt (siehe oben) mit hinzu, ist nichts mehr zu sehen.

Auch spielt eine Schädigung der noch lebenden Probe eine Rolle für die Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops. Nicht nur, dass Licht kurzer Wellenlänge Gewebe schädigen kann, angeregte Farbstoffe sind immer eine Schädigung. Wenn ein Farbstoff nicht “mehr kann” führt der Weg zum bleichen des Farbstoffs über einen Radikalzustand des Moleküls. Dies wird unter dem Begriff “Phototoxizität” zusammengefasst. Die Zwei-Photonen-Mikorksopie ist deutlich schonender, was diesen Aspekt an geht.

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Kommentare (7)

  1. #1 Ludger
    22. März 2015

    Ist ja erst mal erstaunlich, dass die Probe maximal 0,08 mm dick sein darf, wenn das Licht mit derselben Wellenlänge in die Probe hinein und dann wieder heraus muss. Wenn das sichtbare Licht aber in der Probe entsteht, wächst die maximale Dicke nicht auf 0,16 mm sondern gleich auf bis zu 1 mm. Liegt das daran, dass man die Unschärfe durch Streuung vermeidet, weil die Bilder Punkt für Punkt aufgebaut werden?

  2. #2 rolak
    22. März 2015

    An einer Stelle klemmts bei mir: Wenn (was wahrlich nicht angezweifelt wird) das infrarote oder halbFrequente Photon so deutlich tiefer ins Gewebe leuchten, also so deutlich mehr Gewebe durchdringen kann wie das zum normalen Anregen notwendige ganzFrequente Photon — wieso schafft es das emittierte fastGanzFrequente Photon dann retour durch ebenso viel Gewebe?

    Wir sind Brain!

    Und wer gibt den Pinky?

  3. #3 André Lampe
    22. März 2015

    Herzlichen Dank für die beiden Kommentare! Das ist in der Tat ein Aspekt, den ich nicht erklärt habe. Ich schreibe ein update.

  4. #4 André Lampe
    22. März 2015

    Update fertig. Sollte die Frage beantworten, wie das Licht eigentlich zurück kommt. Danke für die Hinweise!

  5. #5 rolak
    22. März 2015

    Ah danke, André – Ludger war ja schon einen Denkschritt weiter, doch mir war der Ausgangspunkt, die (btw von Dir auch vorher schon deutlichst erwähnte) fokussierte Anregung unterwegs entfallen. Wenn bekannt ist, wo es her kommt, kann selbstverständlich egal welches Licht verwertet werden.

  6. #6 Ludger
    22. März 2015

    @ Rolak, #5

    “… schon einen Denkschritt weiter …”

    Ähnliche Dinge wurden im Zusammenhang mit dem letzten Nobelpreis für Chemie beim STED-Mikroskop diskutiert.

  7. #7 rolak
    22. März 2015

    wurden .. diskutiert

    Nicht mit mir, Ludger 😉