Ich habe bereits hier erklärt was ein Durchlichtmikroskop ist. Noch einmal kurz zusammengefasst: Licht geht durch eine Probe, dann durch Linsen und schließlich ins Auge. Und das ist auch ein Problem, wenn die Probe “zu durchsichtig” ist (siehe “ins Auge gehen”). Gerade bei Zellen aus Menschen oder Tieren muss noch etwas getan werden, damit man überhaupt etwas sieht: Anfärben. Aber mit einigen Mikroskopietechniken kann das Hantieren mit Farbstoffen vermieden werden.

Das Dunkelfeldmikroskop hat mich immer schon fasziniert. Hier wird das Licht einer Lampe so geleitet, das zwar die Probe getroffen wird, aber nicht das Objektiv mit dem man beobachtet. Die bereits erwähnten, kleinen Zellen aus einem Menschen absorbieren kaum etwas von diesem Licht, lenken es aber durch Brechung und Streuung ab. Das führt dazu, dass man beim Dunkelfeldmikroskop einen schwarzen Hintergrund sieht und die Zellen (oder was immer man auch betrachtet) hell leuchten – ganz ohne Farbstoff. Ein besonderer Nebeneffekt ist dabei, dass man auch Teilchen sehen kann, die deutlich kleiner sind als die Wellenlänge des Lichts, weil eben auch sie Streuung verursachen. Das führte zur Entwicklung einer weiteren Mikroskop-Art, des Ultramikroskops. Es war dazu gedacht Partikel wie Rauch oder Nebeltröpfchen zu untersuchen, die deutlich kleiner waren als alles was man unter einem normalen Mikroskop erkennen konnte.

Eine etwas trickreichere Variante des Durchlichtmikroskops ist das Phasenkontrastmikroskop. Damit kann man sich das Einfärben von kleinen Zellen ebenfalls sparen. Es wird ausgenutzt, dass fast durchsichtig erscheinende Zellen einen anderen Brechungsindex besitzen als die Flüssigkeit drumherum. Ein unterschiedlicher Brechungsindex bedeutet immer auch, dass sich Licht mit einer klein wenig anderen Geschwindigkeit ausbreitet. Mit dem Ergebnis, dass bei einer kleinen Zelle die Wellenberge und -täler des Lichts etwas nach hinten gerückt werden, verglichen mit den Lichtwellen die nicht durch eine Zellen laufen. Diesen Phasenunterschied sorgt dann dafür, dass eine Dunkle Stelle im Bild entsteht. Man nennt das destruktive Interferenz (Wellenberg + Wellental an gleicher Stelle = dunkel).

Das Dunkelfeldmikroskop und das Phasenkontrastmikroskop nutzen ganz ähnliche Effekte. Im Dunkelfeld-Fall wird ausgenutzt, dass die Richtung des Lichts sich durch Brechung und Streuung ändern kann. Im Phasenkontrast-Fall wird die Phasenverschiebung des Lichts beim Durchlaufen der Zelle benutzt, und nicht die Richtungsänderung.

Ein Cent für meine Zellen

Im Labor benutze ich ein Phasenkontrastmikroskop in der Zellkultur. Dort will ich einen Blick darauf werfen, wie dicht meine Zellen auf den kleinen Deckgläschen gewachsen sind, quasi um zu entscheiden ob ich aus diesen Deckgläschen vielversprechende Proben für meine Arbeit am Hochauflösungsmikroskop machen kann. Ich habe davon Bilder für diesen Blogpost gemacht und darauf geachtet, dass ich immer eine Ein-Cent-Münze im Bild habe, damit man ein Gefühl für die Größenverhältnisse bekommt. Es sind unbehandelte Zellen zu sehen, die ich später, für andere Experimente, benutzt habe*. Daher befindet sich das Deckgläschen in einer Salzlösung, damit die Zellen, die darauf gewachsen sind, nicht austrocknen.

Über der Ein-Cent-Münze kann man erkennen, dass dort wo das Wort "CENT" steht auch der Rand des Objektträger-Gläschens verläuft. This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Über der Ein-Cent-Münze kann man erkennen, dass dort wo das Wort “CENT” steht, auch der Rand des Gläschens verläuft. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Auf dem ersten Bild sind noch keine Zellen auf dem Glas zu erkennen. Kein Wunder, wenn man schon etwas mit dem bloßen Auge sehen könnte, wäre das ja eine schlechte Probe für Mikroskopietechniken, die Zellen sichtbar machen sollten, die für ein Durchlichtmikroskop sogar angefärbt werden müssten, um sichtbar zu sein. Für das nächste Bild habe ich die Münze unter den Probenhalter geklebt. Sie erscheint daher immer ein wenig unscharf, da sie nicht in der selben Ebene liegt wie die Zellen auf dem Deckgläschen. Aber man kann den Verlauf der Rundung des Geldstücks erahnen, und ungefähr abschätzen wie groß die Zellen sind.

Bild aus einem Phasenkontrastmikroskop. Links der Umriss der Ein-Cent-Münze. Die schwachen, hellen Punkte am Rand des Münz-Schattens sind die Zellen, die größeren, dunklen Flecken sind lediglich Staubkörnchen irgendwo auf einer Linse. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Bild aus einem Phasenkontrastmikroskop. Links der Umriss der Ein-Cent-Münze. Die schwachen, hellen Punkte am Rand des Münz-Schattens sind die Zellen, die größeren, dunklen Flecken sind lediglich Staubkörnchen irgendwo auf einer Linse. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Und jetzt schreibe ich, dass die hellen Flecken Zellen sind, wo doch ein Phasenkontrastmikroskop eigentlich die Zellen dunkel darstellen sollte. Der Effekt vom Phasenkontrast ist bei dieser niedrigen Vergrößerung noch nicht sichtbar. Ich benutze ein 10fach Objektiv, bei dem die Vergrößerung noch nicht hoch genug, dass der Interferenzeffekt zum tragen kommt, also dass Gangunterschiede in den Lichtwellen zur Auslöschung führen. Auf der rechten Seite des Bildes kann man höchstens etwas von den Zellen erahnen. Warum also, erscheinen jetzt die Zellen in der Nähe der Münze als helle Punkte oder Umrisse? Das ist Dunkelfeldmikroskopie! Mit der Münze sorge ich dafür, dass nicht das ganze Licht direkt ins Objektiv hineinfallen kann. Als großes, etwas dunkles Band, zieht sich ein Halbschatten der Münze von oben bis unten durch das Bild. Hier werden die Zellen heller, weil sie durch Streuung und Beugung, Licht ins Objektiv lenken.

Übrigens hilft die Angabe, dass ich ein 10fach Objektiv benutze, an dieser Stelle nicht weiter um die Größe der Zellen abzuschätzen. Immer wieder liest man “Dieses Bild hat eine Vergrößerung von 200”, und ich frage mich dann immer “im Vergleich zu was denn, verdammt?”. Generell gilt eine Angabe von “Vergrößerung” auf einem Mikroskop nur für das direkte Reinschauen mit den eigenen Augen. Hat man ein Objektiv mit “10x” und ein Okular mit “2x”, dann ergibt das ein vergrößertes Bild um den Faktor zwanzig (10 mal 2). Mit Bild-Dateien kann man das aber nicht genau so machen, denn dann müsste man auch wissen wie groß die einzelnen Bildpunkte in einer Kamera sind. Das kann von Kamera zu Kamera ziemlich unterschiedlich sein. Mit der Vergrößerung des Linsensystems und der Pixelgröße des Detektors kann man dann ausrechnen wie groß ein Pixel im finalen Bild ist. Das gibt einem dann die Länge eines “scale bar”, der meist in einer Ecke des Bildes sitzt, wie ein Maßstab auf einer Landkarte. Das konnte ich aber in diesem Fall auch nicht machen. Ich hab das Bild mit meiner Handykamera aufgenommen, die ich einfach vor das Okular des Mikroskops gehalten habe. So bin ich dann überhaupt erst auf die Idee gekommen, die Münze unter den Probenbehälter zu kleben, damit man eine Ahnung von den Größenverhältnissen bekommt. Ich hab also etwas improvisiert, was sich dann ja am Ende auch als eine großartige Sache herausgestellt hat: Wenn ich die Münze nicht drunter geklebt hätte, dann hätten wir keinen Halbschatten bekommen, in dem ich auch nicht den Effekt der Dunkelfeldmikroskopie hätte zeigen können. Jetzt drehen wir aber mal am Revolver** und nehmen ein Objektiv mit einer höheren Vergrößerung.

Bild aus dem Phasenkontrastmikroskop. Links wieder die Münze. Rechts kann man schon deutlicher Zellen erkennen. Phasenkontrast (dunkler) und Dunkelfeld (heller) spielen hier zusammen. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Bild aus dem Phasenkontrastmikroskop. Links wieder die Münze. Rechts kann man schon deutlicher Zellen erkennen. Phasenkontrast (dunkler) und Dunkelfeld (heller) spielen hier zusammen. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Es ist nicht immer alles schwarz und weiß, im wahrsten Sinne des Wortes. Hier kommt also ein Kontrast durch die Phase des Lichts und durch die Dunkelfeldmikroskopie zustande. Drehen wir noch ein Objektiv weiter!

Bild aus dem Phasenkontrastmikroskop. Links die Münze, wegen der höheren Vergrößerung erscheint die Münze unschärfer als vorher. Die Zellen sind deutlicher zu erkennen. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Bild aus dem Phasenkontrastmikroskop. Links die Münze, aufgrund der höheren Vergrößerung erscheint die Münze unschärfer als vorher. Die Zellen sind deutlicher zu sehen. (Bild: CC-BY 4.0 André Lampe)

Die Krümmung der Münze ist im letzten Bild kaum noch zu erkennen. Als kleine Hilfe für die Größenabschätzung: Würden wir auf einen Stern am unteren Rand der Münze fokussieren (siehe erstes Bild), würde dieser Stern das gezeigte Blickfeld im letzten Bild mehr als ausfüllen. Ab und zu sieht man noch etwas hellere Umrisse, aber die meisten Zellen zeigen sich jetzt als dunkle Objekte im Bild, mit einem recht prominenten Zellkern in der Mitte und einem nicht so einfach zu erkennenden Randbereich. Das man in diesem Fall nur wenig erkennen kann, trotz der Phasenkontrastmikroskopie, liegt daran, dass dies hier besondere Zellen aus Bindegewebe waren, die relativ flach auf Glas anwachsen. Sie sind zehn bis zwanzig mal so breit und lang wie sie hoch sind. Hier stößt auch die Phasenkontrastmikroskopie an ihre Grenzen, genau wie der Dunkelfeldansatz. Um mehr über diese Zellen zu lernen als ihre bloße Struktur, muss man zu einer anderen Mikroskopietechnik wechseln.

 

Fußnoten:
* man soll ja nix verkommen lassen.
** nicht nur das Schießeisen heißt Revolver, auch das Teil am Mikroskop, an dem mehrere Objektive angebracht sind, heißt so.

Kommentare (18)

  1. #1 Ludger
    17. März 2015

    Mich wundert, dass die Objektbeleuchtung bei Dir nicht monochromatisch ist. Bei mir haben die Phasenkontrastmikroskope grüne Filter auf der Lichtquelle liegen. (Ich gebrauche die Teile als Gynaekologe).

    • #2 André Lampe
      17. März 2015

      Ich hab in diesem Fall Eins benutzt, dass mit einer Blende und einem Phasenring im Objektiv funktioniert. Da kann man auch weißes Licht nehmen. Die sind etwas teurer.
      Wofür benutzt du dein Phasenmikroskop? Ich kenne nur die Labor-Forschungsseite.

  2. #3 rolak
    17. März 2015

    nicht nur das Schießeisen heißt Revolver, auch das Teil am Mikroskop

    Alles dreht sich, auch eine gar nicht so platte Platte.

    Schön demonstriert, wie die für uns Normalos eher exotischen LichtMikroskope funktionieren.

    • #4 André Lampe
      17. März 2015

      Danke!

      Aber bei den exotischen Mikroskopen sind wir noch gar nicht 😉

    • #5 rolak
      17. März 2015

      Kann ich mir lebhaft vorstellen, André – doch schon DunkelfeldMikroskopie ist für die allermeisten derart exotisch, daß es als Würze in quacksalberischem Geseihere gerne eingestreut wird. Funktionierend.
      Für manche hier im Veedel wär schon eine Fahrt nach Bilderstöckchen reine Exotik 😉

      • #6 André Lampe
        17. März 2015

        Es gibt Leute die Dunkelfeldmikroskopie in qucksalberisches Geseihere einstreuen? Interessant… vermutlich weil es so mysteriös klingt. Dann nen lieben Gruß nach Kölle.

      • #7 rolak
        18. März 2015

        Falls jemand nachschauen möchte: In der Branche ist viel von Geldrollen die Rede, doch auch bei Speziellerem wird gerne mit so (scheinbar) widersprüclich klingenden Wort getrumpft.

  3. #8 Ludger
    17. März 2015

    Wofür benutzt du dein Phasenmikroskop?

    Zur Beurteilung des Vaginalsekretes im Rahmen der Entzündungsdiagnostik. Das macht eigentlich jede/r Gynaekologe/in sofort am Stuhl. Man kann sehr gut den Estrogeneinfluss auf Vaginalepithelien beurteilen, Art und Anzahl von Leukozyten, Art der Bakterienflora, Döderlein-Lactobazillen oder Anaerobier, Krankheitserreger wie Pseudomycelien von Hefepilzen, Kocken und natürlich auch dann und wann Trichomonaden. Mikrobiologische Abstriche sind oft von zweifelhaftem Wert. In jeder Vaginalflora kommen auch E.Coli oder Enterokokken vor, die aber meistens nicht die Ursache der Beschwerden sind. Eigentlich brauche ich mikrobiologische Abstriche nur selten und zwar zum Nachweis oder Ausschluss von Streptokokken A. Der Erreger der Plasmazellkolpitis lässt sich gar nicht anzüchten, ist noch nicht mal bekannt, lässt sich aber gut mit Clindamycin wegbekommen.

    • #9 André Lampe
      17. März 2015

      Nicht alles was du aufzählst sagt mir jetzt direkt was. Aber von dem was ich da verstehe, vermute ich mal das du eine Vergrößerung von 60x oder 100x am Objektiv hast und nochmal 10x am Okular oder? Bei der Vergrößerung kosten Objektive mit Phasenring eine Menge Geld – daher hast du vermutlich grünes Licht. Aber durch einen Filter bekommst du noch nicht wirklich monochromatisches Licht, solche Filter sind miestens recht breit mit 40-80nm. Aber das reicht schon für den Phasenkontrast.

      Hast du noch andere Mikroskope, die du regelmäßig für die Diagnostik benutzt? Ich finde das sehr spannend!

  4. #10 tobalt
    17. März 2015

    Wie dick sind denn die zellen ? Ich kann mit dem normarski phasenkontrast stufen von wenigen nanometer höhe sehen, 10 nm sind schon äußerst deutlich. Trifft auch auf durchsichtige schichten zu. Sind die zellen wirklich so flach ?

    • #11 André Lampe
      17. März 2015

      Im Außenbereich sind die Zellen nur einige hundert Nanometer dick. Das klingt zwar viel, aber der Brechungsindex von Zellen unterscheidet sich nur sehr wenig vom umliegenden Salzwasser. Ich habe für die Bilder kein Phasenkontrasmikroskop nach Normarski verwendet, das was ich benutzt habe ist wesentlich ungenauer. Sicher hätte man mit einem Phasenkontrastmirkoskop nach Normarski die Zellen deutlicher gesehen – ich hab aber leider keins da 😉

      Aber abgesehen davon, verraten einem Zellen leider nicht sehr viel mehr im Phasenkontrast. Wenn man einzelne Proteine anfärbt wird es richtig interessant, meiner Meinung nach. Ich bin hier vielleicht auch vom Arbeiten in der biologischen Forschung etwas voreingenommen. Vielleicht hätte ich im Blogpost auf noch weitere Anwendungsgebiete der einzelnen Techniken eingehen sollen. Ich werde das bei Zeiten noch hier anfügen. Für mich liegen meistens Zellen im Fokus (im wahrsten Sinne des Wortes).

      Was hast du denn unter deinem Normarski liegen?

  5. #12 tobalt
    17. März 2015

    Ps: (kann nicht editieren) mit kontinuierlicher quelle

  6. #13 Ludger
    17. März 2015

    Ich habe 3 Olympus-Mikroskope. Bei den beiden Phasenkontrastmikroskopen habe ich jeweils ein 40-fach Objektiv für Phasenkontrast und ein 40-fach Objektiv ohne Phasenkontrast-“Blende” sowie ein 10-fach Objektiv mit Phasenkontrast-Blende”. Die “Blende” im Kondensor ist für das 40-fach Phasenkontrastobjektiv hergestellt. Ich kann die beiden Phasenkontrastobjektive mit demselben Kondensor benutzen und bekomme ein ordentliches Bild. Das Objektiv ohne Phasenkontrast-Blende war ein überflüssiger Fehlkauf. Der Händler wollte mir damals für das 10-fach Phasenkontrastobjektiv eine eigene Kondensor-Blende verkaufen. Diese Blende wird auf den Kondensor aufgesteckt. Zum Glück ist das für die Bildqualität nicht unbedingt nötig. Ich müsste dann wahrscheinlich dauernd den Kondensor zentrieren. So brauche ich das nur alle paar Jahre zu tun. Dafür habe ich eine optische Hilfe, die statt eines Okulars benutzt wird.
    Mein drittes Mikroskop ist ein normales Hellfeldmikroskop mit 10-fach Okularen und 4 Objektiven (4-fach, 10-fach, 40-fach, 100-fach). Das 100-fach ist ein Objektiv für Ölimmersion und ist zur Zeit abgeschraubt. Das hatte ich seinerzeit angeschafft, um nach Lufttrocknung, Hitzefixierung und Gramfärbung nach intrazellulären gramnegativen Diplokokken (Gonokokken) zu suchen. Die anderen Objektive brauche ich für Urinsedimente, z.B. bei jeder Schwangerenvorsorge.
    Ach ja, dann habe ich noch 2 Kolposkope. ( http://de.wikipedia.org/wiki/Kolposkop ). Das sind Stereo-Auflichtmikroskope für die Beurteilung des Gebärmutterhalses aus ca. 30 cm Abstand.

  7. […] einem Phasenkontrastmikroskop würde man diese Viren nicht sichtbar machen können. Selbst mit einem Fluoreszenzmikroskop würde […]

  8. […] Funktionen des Stoffwechsels. Solche Orgänchen oder Organellen kann man vielleicht noch mit einem Phasenkontrastmikroskop erkennen, oder ganz sicher mit den Elektronenmikroskopen am RKI, aber einzelne Eiweiße zu erkennen […]

  9. […] sind viel zu klein um sie zu sehen oder bilden Strukturen mit so geringem Kontrast das auch die Phasenkontrastmikroskopie nicht weiterhelfen kann. Und genau dafür gibt es Farbstoffe, über die ich in Das bringt Farbe ins […]

  10. […] hatte leider keine Farbe zur Hand und besitze auch kein Phasenkontrastmikroskop um solche Bilder aufzunehmen wie Brady Haran für Sixty Symbols. Aber ich wohne in Berlin, und wir […]

  11. #18 Jörg Haus
    Wetzlar
    24. März 2016

    Hallo zusammen,

    hier geht’s leider etwas ungenau zu, was die Beschreibung eines Phasenkontrast-Mikroskops angeht. Den Phasenkontrast erzeugt eine Kombination eines Lichtrings im Kondensor, der auf einen entsprechenden Phasenring im Objektiv abgebildet wird. Die Bedingung für die Phasenverschiebung gilt streng genommen nur für eine Wellenlänge, und das sind gerade 532 nm – grünes Licht eben. Mit einem Grünfilter kann also der Phasenkontrast deutlicher dargestellt werden, viele verwenden ihr Mikroskop aber ohne ihn.

    Noch etwas: Es gibt keinen Phasenkontrast “nach Nomarski”, dafür aber einen so bezeichneten “differentiellen Interferenzkontrast” (DIC).

    Die Dunkelfeldmikroskopie ist übrigens nicht an sich esoterisch beliebt – gehört sie doch zu den klassischen Verfahren z. B. für den Nachweis von Spirochäten. Allerdings zählt ihre Anwendung in der Untersuchung von “Nativblut” zum fortgeschrittensten Humbug, den man heute finden kann.

    Viele Grüße
    Jörg