Diese Grafiken wurde von Marcel Müller an der Uni Bielefeld erstellt, der so etwas generell unter CC-BY-SA lizensiert. Nicht nur das möchte ich gerne erwähnt haben, sondern auch die Arbeit die Marcel in das Softwarepaket fairSIM gesteckt hat. Das ist ein offenes ImageJ Plug-In für SIM (Über ImageJ gibt es mehr bei Basteln ist auch Wissenschaft). Das ist deswegen so etwas Besonderes und Erwähnenswertes, weil es bisher so gut wie nur kommerzielle SIM-Software gegeben hat, von Mikroskopieherstellern die sich bei der Berechnung der Bilder nicht in die Karten schauen lassen wollten. Bei fairSIM kann man sich jede Zeile Programmcode anschauen, aber nicht nur das: fairSIM ist auch noch deutlich schneller als die meisten kommerziellen Programme und zur Zeit arbeiten die Forscher an der Uni Bielefeld an einer Variante die auf Grafikkarten noch ein Stück schneller rechnen können wird. So schnell, dass man höchstens einen Augenaufschlag auf das hochaufgelöste Bild warten muss, und so live seine Probe in SIM-Auflösung betrachten kann. Das ist eine Neuerung, die jeden Biologen begeistern wird und etwas, dass keine kommerzieller Hersteller anbietet. Yeah – open science!

Ich sprach darüber auch in meinem Vortrag auf dem 33. Chaos Communication Congress (33c3). Noch mehr Links zu SIM, Beispiele und den Vortrag selbst gibt es hier.

Stärken / Schwächen

Bei SIM ist eine recht aufwändige Nachbearbeitung der Messdaten durch einen Computer nötig. Dabei wird eine Auflösung von 100nm in der Ebene und 250nm in z-Richtung erreicht. Der große Vorteil ist hier, dass eigentlich alle gängigen Fluoreszenzfarbstoffe für die Technik geeignet sind, und es keinen Unterschied zu einer normalen Probenpräparation gibt.

Ein anderes Beispiel für eine mathematische Überlistung ist Super-resolution optical fluctuating imaging (SOFI).

Physikalische Überlistung

Man kann sich auch das Problem der Beugungsgrenze zu einem gewissen Grad ersparen, wenn man die beleuchtete Fläche kleiner macht. Zwar sind auch fokussierte Laser beugungsbegrenzt, können also das Kriterium „halbe Wellenlänge“ nicht unterschreiten, aber da geht es dann schon los mit der physikalischen Trickserei. Das wohl bekannteste Beispiel dafür wäre STED, Stimulated Emissioen Depletion oder, auf Deutsch stimulierte Emissionsverarmung. Dafür bekam Stefan Hell den Nobelpreis in Chemie 2014.

Dem STED-Ansatz zu Grunde liegt ein konfokales Mikroskop. Dabei wird ein Laser auf einen kleinen (beugungsbegrenzten) Punkt in der Probe foussiert, die Farbstoffe in diesem Punkt werde angeregt und die Fluoreszenz gemessen. Dann wird der Punkt ein kleines Stückchen in der Probe weiter bewegt. So kann man, Punkt für Punkt, Zeile für Zeile ein Bild einer Probe machen, und das geht auch schneller als es sich anhört. Oft braucht man für einen solchen Punkt in einem konfokalen Mikroskop höchstens ein paar Millisekunden Messzeit. Die Trickserei von STED ist jetzt, dass der Messpunkt effektiv kleiner gemacht wird. STED benutzt dafür einen zweiten Laser – der erste Laser den es beim konfokalen Mikroskop gibt ist ja weiterhin beugungsbegrenzt. Der zweite, auch sogenannte STED-Laser wird durch eine Phasenplatte wie ein kleiner Donut geformt, in dessen Mitte der erste Laser liegt.

STED Mikroskop PSFs.jpg
By Marcel Lauterbach – Own work (Original text: Selbst erstellt), CC BY-SA 3.0, Link

Der STED-Laser liegt mit seiner Wellenlänge im gleichen spektralen Bereich, in dem das ausgesendete Licht des benutzten Farbstoffs liegt. Das führt dazu, dass sich angeregte Elektronen in den Farbstoffen denken „Hey, da leuchtet jemand, das wollen wir auch!“ und ihre Energie in Form von Licht der selben Wellenlänge des STED-Laser abgeben. Das nennt man stimulierte Emission. Mit dem STED-Laser räumt man alle angeregten Farbstoffe um das Zentrum dieses Donuts sofort wieder ab. Wenn man jetzt die Leistung des zweiten Laser erhöht, wird das Loch in der Mitte kleiner, und kann auch kleiner als die Beugungsgrenze werden. Deswegen habe ich oben von „effektiv kleiner“ gesprochen. So wird der Punkt, von dem man noch ein effektives Fluoreszenzsignal bekommt kleiner – und die Auflösung besser.

Stärken / Schwächen

Die erreichte Auflösung von STED liegt im Bereich von 50nm in der Ebene und mit mehr Trickserei bei 120nm in z-Richtung. Die Leistungsdichte durch die beiden Laser auf der Probe sind sehr hoch, wenn auch nur für kurze Zeit. Dies kann zum Bleichen der Farbstoffe und zur Beschädigung der biologischen Struktur selbst führen. Im Vergleich zu allen anderen Techniken ist das hochaufgelöste Bild direkt nach der Messung zu sehen, und keine Nachbearbeitung irgendwelcher Rohdaten im Computer ist nötig.

Ein anderes Beispiel für eine physikalische Überlistung ist das optische Rasternahfeldmikroskop (NSOM).

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Kommentare (11)

  1. #1 Johann
    9. Januar 2017

    Klasse Zusammenfassung. Bislang hatte ich noch nicht die Zeit die Primärartikel zu lesen, da kommt das hier genau richtig :).
    Nebenbei erinnerst Du mich daran die 33c3 auf youtube anzusehen, hätte ich fast vergessen

    PS “nicht nur weil die englische Bezeichnung irgendwie schmissiger klingt” Ist rein psychologisch, nach dem Motto das Gras der Nachbarweide ist auch grüner als das der eigenen, sprich, eigentlich Mumpitz und imho hauptsächlich eine deutsche Einstellung.

    • #2 André Lampe
      9. Januar 2017

      Primär Lit kann einem Kopfschmerzen bereiten, ich wünsche dir Kraft 😉

      zum Englischen: Naja, der Blick des Wissenschaftlers der im Fachbereich eh nur englisch kommuniziert hat da eine gewisse Präferenz. Ich würde hier weniger “grünes Gras” sagen, sondern eher Bequemlichkeit und klarere Definition – für jeden Fachbegriff immer eine deutsche Übersetzung zu haben bringt nicht unbedingt Klarheit.

  2. #3 MartinB
    9. Januar 2017

    Toll, danke.

  3. #4 JW
    11. Januar 2017
    • #5 André Lampe
      11. Januar 2017

      Ja, darüber gab es erst am 23.12. eine Pressemitteilung. Was ich daraus, und aus deinem verlinkten Beitrag, gelesen habe lässt mich erstmal etwas skeptisch zurück. Einige Behauptungen, zB “Nanometer genaue Auflösungen und Dynamiken Beobachten (wie bei STED)” sind sehr große Behauptungen. Zum einen, weil STED zwar Dynamiken abbilden konnte, aber längst nicht alle sondern nur ein kleines Subset und zum anderen weil die Nanometergenaue Auflösung bedeuten würde das Dinge wie Beweglichkeit der Markierung, Korrektur von Probenschwingung, Photonenausbeute und noch viele Dinge mehr geklärt sein müssen.

      Wie gesagt: ich bin skeptisch ob der Leistungsumfang dieser Technik wirklich stimmt und ob – so lesen sich die Artikel darüber nämlich – diese Technik bei vielen Proben überhaupt angewendet werden kann. Hinzu kommt noch: Gerade bei der Hochauflösung wird man wissenschaftliche Artikel finden (für jede Technik), die deutlich bessere Auflösungen konstatieren als ich sie hier in der Zusammenfassung stehen habe. Wenn man dann genauer hinschaut sind diese Auflösungen nur für einen sehr engen Spezialfall gültig.

      Ich habe dieses Paper auf der Liste und werde mich dem bald mal annehmen – so lange bin ich skeptisch.

  4. #6 Michael
    12. Januar 2017

    Hallo Andrè,
    Ich beschäftige mich seit Jahren mit Mikroskopie und war gespannt etwas über die „jungen“ Methoden zu erfahren und fand den Vortrag enttäuschend.

    Die Vergrößerungsangaben des Lichtmikroskops erscheinen mir unpassend zu den Bildern der Zellen und 40x als max. Vergrößerung für Phaco ist Unfug!

    Die Vorstellung der neuen Techniken ist für den Laien teilweise zu abgehoben und wohl unverständlich – jedoch für den „Insider“ ohne Tiefgang:
    „SIM ist was mit Moiré und Fourier transformierten Blumen, STED ist richtig was mit Lasern und dSTORM ist massives An-fitten.“
    Eine Erklärung des jeweiligen Effekts (bzw. „Hacks“ im Slang des dortigen Publikums) fehlt mir.

    Hier im Text klemmt die Einteilung in „mathematisch, physikalisch und chemisch“ auch etwas – ohne den physikalischen Effekt der Strukturierten Beleuchtung nützt die Rechnerei nichts. Und die Chemie allein bringt es auch nicht.

    Michael

    • #7 André Lampe
      1. Februar 2017

      Herzlichen Dank für das konstruktive Feedback.

  5. #8 Oliver Keller
    Genf
    8. März 2017

    Ich möchte Michael’s Kommentar #6 etwas widersprechen. Für jemand wie mich, irgendwo zwischen noob und Experte in der Thematik, war der Vortrag genau richtig und bietet viele Anstösse zum Nachlesen. Meiner Erfahrung nach ist das Publikum im CCC Umfeld häufig durchaus mit etwas Vorwissen am Start. Danke für den tollen Talk und diesen ausführlichen Aufschrieb!
    Im Zusammenhang zu open science tools, heute gefunden:
    https://channels.plos.org/open-source-toolkit
    http://collections.plos.org/open-source-toolkit-hardware

    Gruß,
    Oliver
    p.s. Gibt es schon Basteln = Wissenschaft T-Shirts?

    • #9 André Lampe
      8. März 2017

      Hallo Oliver und danke für den Kommentar und das Lob. Mir ist es bisher noch nie in den Sinn gekommen überhaupt über soetwas wie T-Shirts nachzudenken… ich lasse mir das mal durch den Kopf gehen – gute Idee!

      LG, André

  6. #10 Josef
    29. Juni 2018

    Was man auch für den etwas interessierteren Laien ergänzen könnte:
    Bei der Überlagerung zweier Frequenzen (hier: Moir´e Effekt) tritt im Ergebenis sowohl die Summen- als die Differenzfrequenz der beiden überlagerten Frequenzen auf. (das ist immer so, vgl. z.B. auch Schwebung in der Akustik). So ist das auch bei der Überlagerung der bekannten Frequenz der Anregung (Linienmuster) mit der unbekannten Struktur der Probe (Mischung aus vielen Fequenzen). Am einfachsten zum Vorstellen ist es, wenn man annimmt, dass die Probe selbst ein sehr feines Linienmuster ist. Also zu fein um es ohne SIM aufzulösen.
    Die jeweiligen Summenfrequenzen (aus der Frequenz des Anregungsmusters und der jeweiligen Frequenz der Probe) schaffen es nicht durch den Tiefpass des Mikroskop-Objektivs (viel zu fein), die Differenzfrequenzen schon. => Diese müssen bei der Auswertung wieder im Frequenzraum an ihre Frequenz (die sie in der Probe noch hatten) zurückverschoben werden.
    Ich hoffe, einige Klarheiten hiermit beseitigt zu haben.. 😉 😀
    LG, Josef
    P.S.: man kann mit dem Moir´e Effekt auch noch ganz andere tolle Sachen machen 😀

    • #11 André Lampe
      29. Juni 2018

      Danke für die Ergänzung, Josef. Ich finde das einen guten Erklärungsansatz, und zwar ganz ohne “Herumgeschwurbel” mit Fourier-Transformationen ;-). Und danke für den Link zu dem tollen Video.

      Liebe Grüße, André