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Ich hab was gegen Rauschen

Von / 8. September 2015 / 8 Kommentare / Seite 4 von 4 / Auf einer Seite lesen
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Bei diesen 3D Bildern sieht man schon, dass da deutlich mehr “gekrissel” zu sehen ist, also mittendrin auch mal Punkte die offenbar nicht zur Struktur gehören. Würde unser Ansatz nicht schon eine eingebaute Rauschreduktion besitzen, hätten wir diesen Spaß mit der dritten Dimension gar nicht treiben können, unser Signal wäre im Rauschen fast unter gegangen. Denn man bekommt kaum mehr Lokalisationen mit dem 3D Ansatz, man muss also mit fast genau so vielen Lokalisationen wie im 2D Fall gleich mehrere Bild-Ebenen mit kleinen Punkten ausstatten um etwas dreidimensionales zu rekonstruieren. Man könnte jetzt meinen, dass das nicht so richtig der große Wurf ist aber wissenschaftliche Veröffentlichungen, die zweifarbige 3D-Rekonstruktionen mit Hilfe von PLAM, STORM oder dSTORM zeigen, kann man an zwei Händen abzählen.

Unser Artikel ist beim Journal Methods and Application in Fluorescence und kann hier angeschaut werden. Die Software, die die Lokalisations-Paare sucht haben wir als open source veröffentlich. Sie heißt SDmixer und darüber haben wir auch einen Artikel beim selben Journal verfasst. Wer Lust hat mal mit dieser Software herum zu spielen, pre-build binaries für Windows 64bit gibt’s bei Sourceforge, mit Bedienungsanleitung und einem Beispieldatensatz. Den source code der Software kann man sich bei GitHub anschauen und wild für alle anderen Plattformen compilieren, wenn man Lust drauf hat.

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Kommentare (8)

  1. #1 Fliegenschubser
    8. September 2015

    Sehr interessant! Und eine elegante Methode. Eine Auflösing von 25 x 25 x 66nm ist ziemlich gut, gerade in z-Richtung. Ein paar Fragen habe ich:
    Wie lange dauert es einen Datensatz für ein 10um x 10um großes Bild aufzunehmen?
    Und wenn ich das ganze in 3D machen will und ein Volumen von 10 X 10 X 10 um haben möchte?
    Wird aufgrund der tausenden Einzelaufnahmen Photobleaching ein Problem?

    • #2 André Lampe
      8. September 2015

      Da antworte ich doch gerne drauf:

      Die Größe des Bildausschnittes ist nur abhängig davon was du mit dem Laser im Mikroskop beleuchten kannst, wir haben bei uns ungefähr 17,5µm x 34µm Field of view. Man kann so ab 10000 Einzel-Blink-Bildern eine vernünftige Rekonstruktion erreichen, besser sind aber 20000 – kommt halt stark auf die Strukturen an. Letzteres dauert ca. 10 Minuten. Bei 3D ist man recht beschränkt, mit der Zylinderlinse, wie ich es beschrieben habe, hast du nur die Chance 1µm in z aufzunehmen, mit einer Messung. Du kannst aber meistens dann nicht noch höher gehen um “mehr z” aufzunehmen, da haben die Farbstoffe schon ziemlich gelitten und blinken nicht mehr so toll. Photobleaching ist im Prinzip ein Problem, man kann sagen, dass eine Stelle, an der man gemessen hat, nach dieser Messung “tot” ist. Man kann von dort noch Signal bekommen, aber eine schöne Rekonstruktion sieht definitiv anders aus.

      Photobleaching ist “nur” im Prinzip ein Problem, weil dieser dSTORM Puffer auf den Prinzipien von ROXS beruht – das würde auch nicht anders gehen, wir leuchten unser Field of View mit einer Laserleistung von 150mW aus, das entspricht einer Leistungsdichte von ungefähr 5kW/cm^2. Das dieser Blinkeffekt eintritt beruht zum Teil auch dem Pfad, der die Farbstoffe zum Photobleichen bringt. Mit normaler Fluoreszenzmikroskopie haben unsere Leistungen und Pufferbedingungen kaum noch was zu tun.

      Ich hoffe das beantwortet deine Fragen!

  2. #3 Fliegenschubser
    9. September 2015

    Vielen Dank für Antwort!
    10 Minuten für ein Bild (ja, ich bin Biologe, ich mache Bilder, keine Messungen 😉 ) geht noch in Ordnung.
    Die hohe Laserleistung ist natürlich immer ein Problem. Für fixierte Zellen eher weniger, aber mit lebendem Gewebe wirds dann schwierig.
    Ich hätte gern ein Superresolutionmikroskop, mit dem ich 3 Farben in 3D in 15 x 15 x 15 um mit einer 20nm Auflösung aufnehmen kann. Aber soweit ich weiß, existiert das leider nicht…noch nicht. Ein Eingeweihter erzählte mir unlängst von “seinem” neuen STED-Setup, womit sie den anregenden Laserfokus auf 70x70x70nm verkleinert haben. Das ist mittlerweile sogar kommerziell verfügbar, soweit ich weiß.
    Aber auch da hat man eine sehr hohe Laserleistung, die einem die Probe wegbrutzelt, wenn man einen 3D-Stack aufnehmen möchte :/

    • #4 André Lampe
      9. September 2015

      Ich verstehe deine WÜnsche, aber das sind ziemlich große und gewaltige Wünsche. Bis ein so großes Volumen in dieser Auflösung mit drei Farben geht… Nun, ich will dich nicht desillusionieren.

      ABER: Ein bisschen Rückfrage von der technischen Seite… brauchst du wirklich alle drei Farben in Hochauflösung? Würden nicht auch zwei Farben gehen und die Dritte in “normalem” Weitfeld – und dann eben jeweils austauschen? Brauchst du wirklich 15x15x15µm FOV, würdest du nicht evtl mit weniger z auskommen? Aber grundsätzlich kann ich dir sagen: Diese Auflösung in diesem Volumen mit zwei oder drei Farben wird wohl niemals live gehen, immer nur fixiert.

      Dein gewünschtes Volumen mit drei Farben geht heute schon in einem SIM (structured illumination Microscope), da ist die Auflösung aber so um die 100x100x250nm. Hab ich schon mit gearbeitet und sehr schöne Bilder von kompletten Zellkernen mitten in der Teilung gemacht – aber auch nur fixiert.

  3. #5 Fliegenschubser
    10. September 2015

    Ich weiß, ich weiß, das sind eher Wunschträume^^ Ich rechne auch nicht damit, dass eine derartige Technik in naher (oder etwas fernerer) Zukunft existieren wird.

    Mein Arbeitsgebiet ist Embryogenese von Drosophila. Daher sind meine Objekte ziemlich groß und ziemlich 3D (etwa 500 x 160 x 160 um). Der Bereich, der mich interessiert, ist allerdings deutlich kleiner.
    Für die allermeisten Anwendungen ist unser “normales” Konfokalmikroskop auch ausreichend.

    Für Hochauflösung sind auch zwei Farben genug, die dritte (in meinem Fall Zellkerne) muss nur vorhanden sein.
    Meine ersten Versuche mit STED waren so mittelmäßig erfolgreich, was aber (vermutlich) am Färbeprotokoll liegt. Da gibt es noch einiges zu optimieren. Ich werde, wenn ich wieder ein wenig mehr Zeit hab und die Microscope Facility das 3D-STED Setup installiert hat, das auf jeden Fall noch weiter verfolgen.

    • #6 André Lampe
      10. September 2015

      Wenn ich dann so frei sein darf dir ein paar kleine Tipps mit auf den Weg zu geben:

      Wenn man Hochauflösung macht geht nichts über viel Farbstoff. So viel wir nur irgendwie geht sollte man versuchen in die Probe zu bringen. Nicht nur damit Herr Nyquist zufrieden ist, sondern auch damit genug Signal für 3D bleibt. Es lohnt sich da sicher auch über Sekundäre-F(AB)-Fragmente nach zu denken oder über Nanobodies (Lama-ABs), wiel sie kleiner sind und mehr Farbstoff an die Struktur passt.

      Sehr cool, dass du bald ein 3D-STED ausprobieren kannst, ich würde aber auf jeden Fall auch andere Techniken versuchen. Wenn ihr eine Facility habt, hat die sicher auch Kontakte das du evtl mal an ein SIM oder an ein STORM dran kannst. Selbst die absoluten Größen auf dem Gebiet der Hochauflösung können nur schwer eine Empfehlung geben für welche Probe welche Technik die Beste ist. Und ganz im Ernst: Wenn dir Berlin nicht zu weit ist…. hier steht ein echt gutes SIM 😉

      Gewebe ist der Tod jeder Hochauflösung. Es kann reichen, dass durch viel Zellmaterial sich der Brechungindex an der vierten Nachkommastelle ändert, um die tolle Auflösung vollkommen zunichte zu machen. Wenn du schon weißt, dass du tief ins Gewebe willst (“tief” wäre hier für mich mehr als 5µm!), dann mach dir evtl schon früh darüber Gedanken wie du dein Target freipräparierst oder ob Dünnschnitte nicht eine Option wären. Ich hatte mal an Projekt an Fliegen-Larven – die Erkenntnis, dass der Brechungsindex all meine Bemühungen zunichte gemacht hat war ein langer und steiniger.

  4. #7 Fliegenschubser
    10. September 2015

    Du darfst, für derartige Tipps bin ich sehr dankbar^^
    Viel hilft viel, das stimmt wohl, allerdings erhöht zuviel auch den Hintergrund. Ein zu schlechtes SNR war ein Problem beim letzten Mal. Hier werde ich ein verschiedene Verdünnungen/Mengen testen. Nanobodies wären natürlich richtig super, allerdings hab ich keine gegen “meine” Proteine und leider auch nicht die Zeit das vernünftig umzusetzen. Schade eigentlich…
    Im Allgemeinen ist Superresolution für mein Projekt “nur” das i-Tüpfelchen, nicht essentiell. Ich würds trotzdem gern machen, einfach weils fetzt 😀 Aber ich kann leider nicht zu viel Zeit in die Sache investieren, auch weil es nicht sooo erfolgversprechend ist.
    Gewebe ist, wie du sagst, der Tod jeder Hochauflösung. Das ist leider wahr. Und teilweise muss ich schon sehr tief rein ins Gewebe, das geht natürlich nur noch mit entsprechendem Clearing. Aber dann komm ich mit dem Laser durch den gesamten Fliegenembryo (150um). Für normales Confocal reicht das^^

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