Das Bild zeigt den typischen Verlauf von Amplifikationskurven in einer qPCR. Es wurden hier mehrere Proben gleichzeitig gemessen und sie unterscheiden sich in ihrem jeweiligen Ct-Wert.
Ganz wichtig ist bei diesem Verfahren die interne positive Kontrolle (IPC): Dies ist künstlich hergestellte, genau definierte DNA, die der zu untersuchenden Probe vor der PCR zugegeben wird. Es laufen in einem Reaktionsgefäß also zwei qPCR-Reaktionen gleichzeitig ab, damit sind die Reaktionsbedingungen für Probe und IPC identisch und daher vergleichbar. Der Ct-Wert, den die IPC, deren Konzentration und Zusammensetzung man ja genau kennt, erzielen soll, ist aber vorher bekannt. Wenn die PCR unter optimalen Bedingungen abläuft, dann muß die IPC auch den entsprechenden Ct-Wert ergeben.
Ist das nicht der Fall (meist liegt dann der Ct-Wert für die IPC deutlich höher als der Sollwert), so muß etwas die PCR „behindert” haben. Es liegt also ein Beleg für die Gegenwart von Inhibitoren vor:
Im Bild oben ist die Hemmung so stark, daß das Signal der IPC den Schwellenwert überhaupt nicht erreicht. Unsere DNA-Extraktion war also nicht sauber.
Daraus folgt außerdem, daß auch die qPCR-Messung für die eigentliche Probe von den Inhibitoren beeinträchtigt war und die Konzentration nicht korrekt berechnet werden kann. Wir müssen neu extrahieren.
Und natürlich kann es auch vorkommen, daß zwar saubere aber zu wenig DNA extrahiert wurde. In einem solchen Fall funktioniert die IPS ganz normal, aber es kann kein Ct für die Probe bestimmt werden:
Eine andere Situation, in der man ein Signal für die IPC nicht aber für die Probe bekommen würde, wäre, wenn die DNA zu stark beschädigt, also fragmentiert ist. Bei der qPCR zur DNA-Konzentrationsbestimmung, die wir verwenden (als Kit von einem bestimmten Hersteller), wird ein Abschnitt von ca. 60 bp (für Interessierte: aus dem humanen Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gen) vervielfacht, der im Genom jedes Menschen vorkommt. Dieser Abschnitt muß in einem Stück vorliegen, damit er in einer PCR vervielfältigt werden kann (sonst erreicht die DNA-Polymerase das Ende des Stücks nicht und kann keine Kopie der Gegenprimerbindestelle herstellen). Wenn die DNA aber so stark beschädigt ist, daß die Fragmentlänge durchschnittlich unterhalb von 60 bp liegt, so funktioniert eine PCR, die ein 60 bp großes Amplifikat erzeugen soll, nicht mehr:
Im Idealfall erhält man den Sollwert für die IPC und einen schönen, satten Ct für die Probe. Dann weiß man: man hat genug (menschliche) DNA extrahiert, sie ist nicht hoffnungslos fragmentiert und enthält keine Inhibitoren. Es kann also weitergehen auf dem langen Weg zum DNA-Profil! In der nächsten Folge unserer beliebten Serie mache ich aber erstmal einen Exkurs ins Genom und berichte von Mikrosatelliten und Short Tandem Repeats.
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