In der letzten Folge habe ich über DNA-Extraktion berichtet, die Kunst, genug, intakte und saubere DNA aus Spurenmaterial zu gewinnen. In diesem Beitrag beschreibe ich, wie man feststellt, ob auch wirklich genug DNA da ist und ob diese auch wirklich sauber ist.
Tip: Vorher über PCR informieren.
Es gibt mehrere Verfahren/Geräte, die Konzentration von Nukleinsäuren in wäßriger Lösung zu bestimmen. Sie beruhen auf unterschiedlichen Prinzipien und unterscheiden sich in Handhabung, Genauigkeit, Aufwand und Preis. Ich werde im Folgenden drei Verfahren beschreiben:
Ein altes und „klassisches” Verfahren ist die photometrische Bestimmung. Hierbei macht man sich zunutze, daß Nukleinsäuren Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren. Die Lösung mit der zu messenden DNA wird in eine Quarz-Küvette gegeben und mit UV-Licht der Wellenlänge 260 nm durchleuchtet. Je mehr DNA sich in der Lösung befindet, desto mehr Licht wird absorbiert (Schema).
Man bestimmt letztlich die „Extinktion”, E, also das Ausmaß des von der DNA abgefangenen Lichts und kann daraus, da man den Lichtweg, Küvettendicke -volumen und -material kennt, die Konzentration der DNA bestimmen:
C: Konzentration der DNA
E: Extinktion
ε: molarer, dekadischer Extraktionskoeffizient [L/cm x mol]
d: Schichtdicke der Küvette
Das Verfahren ist nicht sonderlich genau, recht unspezifisch und störanfällig, daher findet es in der Forensik kaum noch Anwendung.
Ein neueres und besseres Verfahren ist die fluormetrische Messung. Hier wird die DNA zuvor mit einem Fluoreszenzfarbstoff gemischt, der, wenn er an doppelsträngige DNA gebunden ist und von Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt wird, leuchtet. Das bedeutet, je mehr DNA in der Lösung vorliegt, desto mehr Farbstoff ist gebunden, desto stärker die Fluoreszenz. Um das Leuchten quantifizieren zu können, muß zuvor eine Kalibrierungsgerade angelegt werden: es wird die Fluoreszenz mehrerer Proben mit bekannter Konzentration gemessen. Die Messwerte liegen ziemlich genau auf einer Geraden, deren Zuordnungsvorschrift (Geradengleichung) man regressiv ermitteln kann.
Diese Gleichung gestattet dann die Berechnung der Konzentration einer unbekannten Probe aus einem Fluoreszenzwert nach der Formel:
mit
F: Fluoreszenzintensität
K: Konzentration
c: Ordinatenabschnitt
m: Steigung
Angenehmerweise übernimmt das Gerät diese Prozedur für einen, so daß man nur die bekannten Proben messen und dem Gerät mitteilen muß, daß dies die Messpunkte für die Kalibrierung waren. Danach kann man einfach die unbekannten Proben einsetzen, messen und das Gerät gibt direkt die richtige Konzentration aus.
In der Forensischen Genetik findet jedoch meist eine dritte Methode Anwendung: eine bestimmte Form der quantitativen PCR zur Messung der DNA-Konzentration. Die quantitative PCR (qPCR) ist eine besonders tolle Variante der PCR (die übrigens mein persönliches Steckenpferd ist) und allein über diese Methode gibt es ganze, dicke Bücher. Die Optimierung einer qPCR ist fast eine eigene Wissenschaft und ich will an dieser Stelle auch gar nicht en detail auf die qPCR eingehen (vielleicht mal in den „Basics”). Nur soviel: Dieses Verfahren ist wesentlich aufwendiger als die beiden zuvor beschriebenen, da es ja eine komplette PCR, mit Primern, Polymerase, Nukleotiden etc. umfasst. Es hat allerdings den großen Vorteil, nicht nur sehr genau zu sein, sondern auch anzuzeigen, ob die DNA jenseits einer bestimmten Grenze fragmentiert ist und ob die Extraktion, die man hergestellt hat, PCR-Inhibitoren enthält. Als Bonus kommt noch hinzu, daß das Verfahren für die forensischen Anwendungen so gut wie immer humanspezifisch ist, d.h. man kann menschliche von nicht-menschlicher DNA unterscheiden (sehr praktisch, wenn man nicht weiß, von welcher Spezies z.B. eine bestimmte Blutspur stammt).
Die Konzentrationsmessung funktioniert ähnlich, wie bei der Fluorometrie: auch hier wird die Intensität eines Fluorszenzsignals mit der Menge des in Frage stehenden Moleküls korreliert, indem man eine Kalibrierungsgerade generiert.
Der zentrale Messwert, den eine qPCR ausgibt, ist der sog. Ct (Schwellenwertzyklus), der angibt, in welchem PCR-Zyklus die Fluoreszenz der Probe einen bestimmten Schwellenwert (der so gewählt wird, daß er in der exponentiellen Amplifikationsphase der PCR liegt) erreicht. Aus dem Ct kann dann sehr genau die Konzentration berechnet werden. Es gilt: Je niedriger der Ct-Wert, desto größer war die Ausgangsmenge der Probe und umgekehrt.
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