Haare haben eine RNA-Uhr

Ich bin ja ein Fan aller Arten von RNA und interessiere mich daher besonders für forensische RNA-Analytik. Neulich erschien im Journal of Forensic Sciences ein Paper, welches die Alterbestimmung von Haaren an Tatorten mittels RNA-Expressionsanalyse beschreibt.
Die Autoren griffen auf eine Methode zurück, die schon zuvor von Anderson et al. für Blutspuren beschrieben worden war und optimierten und validierten diese Methode zur Anwendung auf Haare.

Empfohlene vorbereitende Lektüre: Genexpressionsregulation.

Häufig ist für die Aufklärung eines Verbrechens die Kenntnis der Tatzeit entscheidend. Manchmal ist diese jedoch nicht einfach zu festzustellen und muß indirekt durch den Zeitpunkt, zu dem biologische Spuren am Tatort abgegeben wurden, bestimmt werden. In anderen Fällen steht und fällt der Wert einer biologischen Spur mit der Kenntnis des Zeitpunkts, zu dem sie gelegt wurde.
Das Alter biologischer Spuren ist jedoch nicht leicht zu bestimmen, da ihre Zersetzung keinen einfach zu beschreibenden Gesetzmäßigkeiten gehorcht, daher forschen immer wieder forensische Wissenschaftler an biologischen Markern, an denen man, wie auf einer Stoppuhr, die Zeit ablesen kann, die seit dem Zeitpunkt vergangen ist, zu dem die Zellen ihren ursprünglichen Körper(zusammenhang) verlassen haben.

Bis vor kurzem gab es keine verläßliche Methode zur Alterbestimmung von Haaren, obwohl Haare, neben Blut, Speichel und Sperma, zu den häufigsten biologischen Spuren an den Tatorten von Verbrechen gehören. Häufig liefern gerade Haare Hinweise oder bestärkende Evidenz, um eine Person mit einem Tatort oder einem Gegenstand in Verbindung bringen zu können.
Für die Bestimmung des Alters von Blutspuren wurden indes schon einige Anstrengungen unternommen: Andersen et al. haben 2005 dafür eine RNA-abhängige Methode beschrieben, die nun Hampson et al. für Haare „neu entdeckt” und optimiert haben.

Das Prinzip dieser RNA-Methode beruht auf der Messung des relativen Expressionsverhältnisses, der „relative expression ratio” (RER) von zwei verschiedenen Arten von RNA. Dazu muß man wissen: es gibt in der Zelle viele verschiedene Spezies von RNA (und es wird sicher mal einen Basics-Artikel darüber geben). Die mRNA habe ich im Post zu Genexpressionschon erwähnt. Eine andere Sorte ist die sogenannte „ribosomale RNA” (rRNA), die zum Baumaterial der Proteinfabriken, den Ribosomen, gehört. Diese beiden Sorten von RNAs haben in der Zelle unterschiedliche Haltbarkeiten und sind auch unterschiedlich in Hinsicht auf ihr postmortales Überdauern und genau das macht man sich hier zunutze.

Zunächst zum Material: für diese Studie haben die Autoren von 10 Personen (5 Frauen, 5 Männer, unterschiedliche Altersgruppen) für 9 Intervalle (0, 1, 5, 15, 30, 45, 60, 75 und 90 Tage) je 20 Haare mit Wurzel ausgerupft.
(ja, ich habe mir an dieser Stelle auch überlegt, daß es sicher nicht lustig für die Probanden war, sich 180 Haare einzeln ausraufen zu lassen)

Die Haare wurden dann kontrolliert gealtert, indem sie für eine ihrem jeweils zugeordneten Intervall entsprechende Zeit in sterilen Plastikreaktionsgefäßen den diurnalen Schwankungen von Luftdruck, Luftfeuchtigkeit, UV-Bestrahlung und Temperatur ausgesetzt wurden.

Aus den Haaren wurde dann RNA extrahiert und diese revers zu cDNA transkribiert (für die PCR wird ja immer DNA benötigt). Diese cDNA diente dann als Grundlage für die quantitative PCR (,die hier auch schon erwähnt wurde).
In dieser Studie wurde viel Arbeit in die Optimierung dieser PCR investiert, ich überspringe aber diesen sehr technischen Teil, da er nur für qPCR-Kenner interessant sein dürfte und für das Verständnis der Daten nicht notwendig ist.

Jedenfalls wurden in dieser qPCR durch Verwendung von zwei für je eine der RNAs spezifischen Assays (so nennt man die Kombination eines spezifischen Primerpaares und einer spezifischen Sonde, die einen Fluoreszenzfarbstoff trägt, dessen Leuchten detektiert wird und als Messgrundlage für die Amplifikation dient), gleichzeitig die cDNA-Äquivalente der Beta-Aktin-mRNA und der 18S-rRNA vervielfältigt.
Am Verlauf der Reaktion, dem man bei der Technik der qPCR in „Echtzeit” (weswegen man sie manchmal auch „Realtime-PCR” nennt) zusehen kann, kann man sehr exakt auf die Ausgangsmenge der jeweiligen cDNAs und damit RNAs schließen und schließlich auch ein Mengenverhältnis von zwei oder mehr cDNAs berechnen, das relative Expressionsverhältnis (RER). Zunächst sahen sich die Forscher aber die Stabilität der einzelnen RNAs an:

Die relative Expression (RE) ist hier ein proportionales Maß für die Intaktheit der RNA. Die Abbildung zeigt, daß, bezogen auf Tag 0, für den die RE willkürlich gleich 1 gesetzt wurde, sich die beiden RNAs ganz anders verhalten. Während die RE der Beta-Aktin-mRNA stetig abnimmt (mit einem besonders starken Abfall am ersten Tag), bleibt die RE der 18S-rRNA, die allerdings auch den Abfall am ersten Tag zeigt, danach erst einmal relativ konstant und ändert sich nennenswert erst ab dem 60. Tag. Beide RNAs sind aber noch bis zum 90. Tag nachweisbar. Dieses unterschiedliche Verhalten, das ja die Grundlage für die Verwendung dieser beiden RNAs als biologische Timer bildet, rührt sehr wahrscheinlich daher, daß die rRNA im Strukturzusammenhang des Ribosoms eingebettet und daher der sich zersetzenden Zellumgebung nicht so stark ausgesetzt ist, wie die “freie” mRNA. Die Ribosomen zerlegt es erst nach einer deutlich längeren Zeit, wodurch die rRNA schließlich freigesetzt und dann den gleichen Zerfallsprozessen ausgeliefert wird.
Der bei beiden RNA-Arten beobachtete Abfall der RE nach dem ersten Tag (der bei allen 10 Spendern beobachtet wurde) erklärt sich wahrscheinlich durch erhöhte intrazelluläre Enzymaktivität, die abhängig von der natürlichen wässrigen Umgebung ist, die allen lebenden Zellen gemeinsam ist.
Ein weiteres Ergebnis dieser Untersuchung war, daß Geschlecht und Alter offenbar keinen Einfluss auf die RE haben.

Im folgenden wurde dann der Verlauf der RER über die Zeit dargestellt und es ergab sich folgendes Bild:

Es zeigt sich, daß die RER über die Zeit kurvenförmig und halbwegs regelhaft verläuft, so daß, angesichts normalverteilter RER-Werte, die Formulierung einer Zuordnungsvorschrift plausibel erscheint. Die RER-Werte verhalten sich linear und reproduzierbar mit einer relativ starken Korrelation bis zu 45 bis maximal 60 Tage. Danach flacht die Kurve ab und ein Plateau-Effekt tritt auf. Die Konfidenz der Schätzwerte variiert also über die 90 Tage-Periode, aber Proben, die weniger als 30 tage gealtert waren, konnten recht gut in ein 10-15 Tage-Fenster eingeordnet werden.
Innerhalb der von den Autoren sehr genau erkannten und auch diskutierten Grenzen der Genauigkeit, die durch die geringe Probenzahl und diverse technische Varianzen gesteckt werden, kann also von der RER der Beta-Aktin-mRNA und der 18S-rRNA auf das Alter einer Haarprobe geschlossen werden:

Die Abbildung zeigt die zeitweise Entwicklung der RER-Mittelwerte und den Verlauf eines extrapolierten Funktionsgraphen, der diesen Trend modelliert. Das folgende Polynom zweiter Ordnung ist dann die Formel, auf die sich die Ergebnisse der Studie verdichten lassen:

Um das Alter (A) eines an einem Tatort sichergestellten Haares innerhalb einer bestimmten Ungenauigkeit zu ermitteln, muß man also nur noch die RER der beiden RNAs (beta-Aktin und 18S) im gefundenen Haar bestimmen, in die Formel einsetzen, und A ausrechnen.

Verbessern ließen sich solche Altersschätzungen, wenn nicht nur zwei, sondern mehrere und vielleicht noch bessere Marker für solche Zerfallsprozesse untersucht und die Messdaten dann geometrisch gemittelt würden.

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Literatur:

Hampson C, Louhelainen J, & McColl S (2011). An RNA expression method for aging forensic hair samples. Journal of forensic sciences, 56 (2), 359-65 PMID: 21281307

Anderson S, Howard B, Hobbs GR, Bishop CP. A method for determining the age of a bloodstain. Forensic Sci Int. 2005 Feb 10;148(1):37-45.