Obwohl die Fragmente gleich lang sind, sind sie nun an ihrer Farbe zu unterscheiden.
Die Ermittlung der Größe eines Fragments schließlich gelingt durch einen Vergleich mit einem internen Größenstandard. Man kann sich das wie ein Lineal vorstellen, das man benutzt, um einen Faden unbekannter Länge zu messen, indem man den Faden daneben hält. Ein Größenstandard in unserem Fall ist eine künstlich hergestellte Mischung aus DNA-Fragmenten bekannter Größe, die natürlich alle, wie die vorvorige Abbildung zeigt, einen eigenen Farbstoff tragen (hier “lila”), der nicht für eines der getesteten STR-Syteme verwendet wird, damit DNA-Fragemente des Größenstandard und der zu untersuchenden Probe klar auseinandergehalten werden können.
Die stark vereinfachte Abbildung zeigt, wie man durch Vergleich mit den Fragmenten eines Größenstandard die Größe der beiden Allele des STR-Systems 1 bestimmen kann. Die “Zacken” repräsentieren hier jeweils ein DNA-Fragment: in diesem Beispiel hätten die Fragmente/Allele des STR-Systems 1 also die Größen 150 bp und 250 bp.
Eine solche Multiplex-PCR zu entwicklen, zu optimieren und als „Kit” marktreif zu machen, ist eine Kunst für sich. Es müssen geeignete Primer designt und aufeinander abgestimmt werden und zwar so, daß jede Einzel-PCR in etwa die gleiche Effizienz aufweist, die Kombinationen von Längen und Farbstoffen müssen berechnet, ein geeigneter Größenstandard muß hergestellt und eine optimale „Chemie” (ein Gemisch aus Salzen, Stabilisatoren und Lösemitteln, die die Grundlage der chemischen Reaktion bildet) muß zusammengestellt werden. Angesichts der höchsten Ansprüche, die solche Kits erfüllen und angesichts der peniblen und umfangreichen Validierung, die sie dafür durchlaufen müssen, ist das insgesamt ein langwieriges, aufwendiges und teures Unterfangen, das sich die Hersteller, die solche Kits für forensische STR-Multiplex-PCRs anbieten, auch sehr gut bezahlen lassen.
Nach der Multiplex-PCR liegen jedoch erst einmal alle Fragmente wild gemischt in einem einzigen Reaktionsgefäß vor, von einem geordneten DNA-Profil sind wir so noch weit entfernt. STR-Allele unterscheiden sich, wie erwähnt, in der Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten. Dadurch sind sie unterschiedlich lang und genau dieser Längenunterschied soll gemessen werden. Und zwar auf das einzelne Nukleotid genau, da ja auch die sogenannten „Punktallele” (s. hier), die nur ein Nukleotid länger oder kürzer als ein anderes Allel sein können, voneinander unterschieden werden müssen. Um diese Fragmente so exakt der Größe nach zu ordnen, ihre Größe zu messen und ihre Farbe erkennen zu können, müssen wir nun eine Kapillarelektrophorese durchführen.
Das Prinzip der Elektrophorese ist irgendwann einen eigenen Basics-Artikel wert, daher nur so viel: DNA-Fragmente sind in wässriger Lösung negativ geladen und bewegen sich in einem elektrischen Feld daher immer zum positiv geladenen Pol (Anode). Da bei der DNA die Linienladungsdichte konstant und die Anzahl der Ladungen proportional zur Länge ist, bestimmt die Länge eines DNA-Fragments, wie rasch ein solches zur Anode wandert: je länger ein DNA-Fragment ist, desto langsamer wandert es. Gibt man ein Gemisch von unterschiedlich langen DNA-Fragmenten in eine gleichmäßig aufgebaute Matrix (wie ein Netz) und legt daran eine Spannung an, so beginnt ein „Wettrennen” der DNA-Fragmente, die sich durch die Matrix drängen und sich exakt gemäß ihrer Länge hintereinander „einreihen”.
Genau dieses Prinzip nutzt man bei der Kapillarelektrophorese: die Matrix, hier ein bestimmtes, hochwertiges Polymer, ist in einer haardünnen Kapillare untergebracht, die in das Reaktionsgefäß eingetaucht wird. Durch Elektroden wird ein starkes elektrisches Feld erzeugt, so daß die Fragmente in die Kapillare eintreten und durch das Polymer Richtung Anode wandern können.
Quelle: https://www.pharmchem.tu-bs.de/
An einer Stelle der Kapillare befindet sich ein „Fenster”, eine durchsichtige Öffnung, durch die ein Laserstrahl geschossen wird. An diesem Fenster wandern die Fragmente, schön der Größenreihe nach, vorbei. Das Laserlicht trifft sie, regt die Fluorphore, die an die Fragmente gebunden sind, zum Leuchten in ihrer jeweiligen Farbe an und dieses Leuchten wird von einem gegenüberliegenden Detektor registriert. Somit werden die beiden „Datenpunkte” Länge und Farbe erhoben und einem bestimmten Fragment zugeordnet.
Eine Software erstellt aus diesen Rohdaten und unter Einbeziehung der bekannten Werte für den Größenstandard ein Elektropherogramm.
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