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Obwohl die Fragmente gleich lang sind, sind sie nun an ihrer Farbe zu unterscheiden.

Die Ermittlung der Größe eines Fragments schließlich gelingt durch einen Vergleich mit einem internen Größenstandard. Man kann sich das wie ein Lineal vorstellen, das man benutzt, um einen Faden unbekannter Länge zu messen, indem man den Faden daneben hält. Ein Größenstandard in unserem Fall ist eine künstlich hergestellte Mischung aus DNA-Fragmenten bekannter Größe, die natürlich alle, wie die vorvorige Abbildung zeigt, einen eigenen Farbstoff tragen (hier “lila”), der nicht für eines der getesteten STR-Syteme verwendet wird, damit DNA-Fragemente des Größenstandard und der zu untersuchenden Probe klar auseinandergehalten werden können.

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Die stark vereinfachte Abbildung zeigt, wie man durch Vergleich mit den Fragmenten eines Größenstandard die Größe der beiden Allele des STR-Systems 1 bestimmen kann. Die “Zacken” repräsentieren hier jeweils ein DNA-Fragment: in diesem Beispiel hätten die Fragmente/Allele des STR-Systems 1 also die Größen 150 bp und 250 bp.

Eine solche Multiplex-PCR zu entwicklen, zu optimieren und als „Kit” marktreif zu machen, ist eine Kunst für sich. Es müssen geeignete Primer designt und aufeinander abgestimmt werden und zwar so, daß jede Einzel-PCR in etwa die gleiche Effizienz aufweist, die Kombinationen von Längen und Farbstoffen müssen berechnet, ein geeigneter Größenstandard muß hergestellt und eine optimale „Chemie” (ein Gemisch aus Salzen, Stabilisatoren und Lösemitteln, die die Grundlage der chemischen Reaktion bildet) muß zusammengestellt werden. Angesichts der höchsten Ansprüche, die solche Kits erfüllen und angesichts der peniblen und umfangreichen Validierung, die sie dafür durchlaufen müssen, ist das insgesamt ein langwieriges, aufwendiges und teures Unterfangen, das sich die Hersteller, die solche Kits für forensische STR-Multiplex-PCRs anbieten, auch sehr gut bezahlen lassen.

Nach der Multiplex-PCR liegen jedoch erst einmal alle Fragmente wild gemischt in einem einzigen Reaktionsgefäß vor, von einem geordneten DNA-Profil sind wir so noch weit entfernt. STR-Allele unterscheiden sich, wie erwähnt, in der Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten. Dadurch sind sie unterschiedlich lang und genau dieser Längenunterschied soll gemessen werden. Und zwar auf das einzelne Nukleotid genau, da ja auch die sogenannten „Punktallele” (s. hier), die nur ein Nukleotid länger oder kürzer als ein anderes Allel sein können, voneinander unterschieden werden müssen. Um diese Fragmente so exakt der Größe nach zu ordnen, ihre Größe zu messen und ihre Farbe erkennen zu können, müssen wir nun eine Kapillarelektrophorese durchführen.

Das Prinzip der Elektrophorese ist irgendwann einen eigenen Basics-Artikel wert, daher nur so viel: DNA-Fragmente sind in wässriger Lösung negativ geladen und bewegen sich in einem elektrischen Feld daher immer zum positiv geladenen Pol (Anode). Da bei der DNA die Linienladungsdichte konstant und die Anzahl der Ladungen proportional zur Länge ist, bestimmt die Länge eines DNA-Fragments, wie rasch ein solches zur Anode wandert: je länger ein DNA-Fragment ist, desto langsamer wandert es. Gibt man ein Gemisch von unterschiedlich langen DNA-Fragmenten in eine gleichmäßig aufgebaute Matrix (wie ein Netz) und legt daran eine Spannung an, so beginnt ein „Wettrennen” der DNA-Fragmente, die sich durch die Matrix drängen und sich exakt gemäß ihrer Länge hintereinander „einreihen”.

Genau dieses Prinzip nutzt man bei der Kapillarelektrophorese: die Matrix, hier ein bestimmtes, hochwertiges Polymer, ist in einer haardünnen Kapillare untergebracht, die in das Reaktionsgefäß eingetaucht wird. Durch Elektroden wird ein starkes elektrisches Feld erzeugt, so daß die Fragmente in die Kapillare eintreten und durch das Polymer Richtung Anode wandern können.

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Quelle: https://www.pharmchem.tu-bs.de/

An einer Stelle der Kapillare befindet sich ein „Fenster”, eine durchsichtige Öffnung, durch die ein Laserstrahl geschossen wird. An diesem Fenster wandern die Fragmente, schön der Größenreihe nach, vorbei. Das Laserlicht trifft sie, regt die Fluorphore, die an die Fragmente gebunden sind, zum Leuchten in ihrer jeweiligen Farbe an und dieses Leuchten wird von einem gegenüberliegenden Detektor registriert. Somit werden die beiden „Datenpunkte” Länge und Farbe erhoben und einem bestimmten Fragment zugeordnet.
Eine Software erstellt aus diesen Rohdaten und unter Einbeziehung der bekannten Werte für den Größenstandard ein Elektropherogramm.

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Kommentare (17)

  1. #1 Stefan
    18/06/2011

    “Da bei DNA die Ladungsdichte proportional zur Länge ist, bestimmt die Länge eines DNA-Fragments, wie rasch ein solches zur Anode wandert.”
    Ist es nicht so, dass die LadungsDICHTE unabhängig von der Länge ist, nämlich zwei negative Ladungen pro Basenpaar bei doppelsträngiger DNA? Du willst doch damit sagen, dass die Anzahl der Ladungen proportional zur Länge der DNA-Fragmente ist. Oder habe ich den Begriff der Ladungsdichte falsch verstanden und er bezeichnet genau das?
    Wichtigere Frage: Der Satz oben erweckt den Eindruck, dass längere Moleküle mit mehr negativen Ladungen schneller im Polymer wandern. Ich dachte, es wäre so wie bei der Agarose-Gelelektrophorese, dass sich kürzere Fragmente nicht so sehr im Polymer “verheddern” wie große Moleküle und daher trotz einer niedrigeren Anzahl an Ladungen schneller durchlaufen…oder bin ich hier komplett aufm Holzweg?
    Gruß Stefan

  2. #2 Cornelius Courts
    20/06/2011

    @Stefan: “Du willst doch damit sagen, dass die Anzahl der Ladungen proportional zur Länge der DNA-Fragmente ist.”

    Danke für den Hinweis, die Formulierung ist tatsächlich etwas unglücklich. Die Linienladungsdichte ist definiert als “Ladung pro Längeneinheit”, d.h. umso mehr Ladung, desto länger, die Ladung nimmt also proportional zur Länge zu.
    Ist verbessert.

    “er Satz oben erweckt den Eindruck, dass längere Moleküle mit mehr negativen Ladungen schneller im Polymer wandern”
    Auch hier: guter Hinweis auf unzureichende Formulierung, danke. Natürlich ist es auch bei der Kap.El. so, daß die längeren Fragmente langsamer wandern (gerade WEIL sie im Verhältnis nicht stärker geladen sind, als kürzere). Die Formulierung, “die Länge bestimmt, wie rasch…” widerspricht dem nicht, ist aber zur Vermeidung von Mißverständnissen verbesserbar. Soeben geschehen.

  3. #3 Stefan
    20/06/2011

    @CC: alles klar, dann bin ich beruhigt, dass ich nicht komplett daneben lag 🙂 Übrigens: keep up the good work! Ich lese hier wirklich sehr gerne! Gruß Stefan

  4. #4 Cornelius Courts
    20/06/2011

    @Stefan: “keep up the good work! Ich lese hier wirklich sehr gerne!”
    Danke Dir! 🙂

  5. #5 Katja
    13/07/2011

    Hallo,
    vorab ersteinmal vielen Dank für die tollen Artikel, die mir während meiner Arbeit wirklich weiterhelfen.
    Meine Frage:
    Was genau signalisieren denn nun die Achsen im Elektropherogramm? Die X-Achse beschreibt das Allel, die Y-Achse (die ja relative hohe Werte annimmt z.b. 5700) beschreibt die Basenlänge des STRs??? Und der obere Bereich (wie z.B. 150) gibt die Länge der Basen des Allels im STR an?
    Das habe ich sicherlich falsch verstanden. Bitte um Aufklärung.
    Vielen Dank.
    katja

  6. #6 Cornelius Courts
    14/07/2011

    @Katja: das Elektropherogramm liest sich so:
    die “X-Achse” repräsentiert die Länge eines Fragments: je weiter rechts, desto länger ist das Fragment (das siehst Du daran, daß die Allele mit den höheren Zahlen in einem System immer rechts stehen). Die kleinen Zahlen geben die Basenlänge an. Wichtig ist, zu verstehen, daß es für jede “Farbe” eine X-Achse gibt (hier 4) und daß so auch gleichgroße Fragmente (wie z.B. Allel 15 in D3S1358 und Allel 14 in D19S433) anhand der Farbe unterschieden werden können. Es kann zudem durchaus vorkommen, daß ein Allel in einem System eine höhere Zahl hat als ein Allel in einem anderen System derselben Farbe (z.B. Allel 28 in D21S11 / Allel 12 in D18S51) und trotzdem das zugehörige DNA-Fragment kleiner ist. Das liegt daran, daß die Allelbezeichnung ja nur die Anzahl der Widerholungen angibt und nichts über die absolute Fragmentlänge aussagt.

    Die “Y-Achse” gibt die Peakhöhe, also die Signalintensität an. Die Einheit sind “rfu”, sie “relativen Fluoreszenzeinheiten”. Je mehr Kopien eines Fragmentes detektiert werden, desto höher wird ein Peak. In einem “balancierten” Profil sollten die beiden Peaks eines Systems etwa gleich hoch sein, weil dann beide STR-Systeme eines Chromosomenpaares gleich gut in der PCR verfielfältigt worden sind. Im vorliegenden Profil ist das so.

    Hoffe, das hilft Dir weiter und danke für die Rückmeldung.

  7. #7 Sue-Mie
    11/01/2012

    Danke für diesen wunderbaren Blog,
    ich lese erst vor kurzem hier und muss sagen, super Sache, perfekt verständlich.
    Das hat mir wirklich sehr geholfen!
    LG

  8. #8 Cornelius Courts
    12/01/2012

    @Sue-Mie: danke für die Rückmeldung – freut mich, wenn es hilfreich war 🙂

  9. #9 Maria
    15/05/2012

    Du hast geschrieben: “DNA-Fragmente sind in wässriger Lösung negativ geladen und bewegen sich in einem elektrischen Feld daher immer zum positiv geladenen Pol (Anode).” In der Abbildung sieht es aber so aus, als ob die Fragmente sich in Richtung Kathode bewegten (s. Pfeil). Wie ist das zu verstehen?

  10. #10 Cornelius Courts
    15/05/2012

    @Maria: ja, diese Unstimmigkeit erklärt sich durch die Inkonsistenz bei der Verwendung der Begriffe für die Stromrichtung:
    https://de.wikipedia.org/wiki/Technische_Stromrichtung#Elektrischer_Strom_vs._Elektronenstrom_vs._Ionenstrom

    Der PFeil würde sozusagen die technische Stromrichtung anzeigen.

  11. #11 Freschta
    12/12/2014

    Danke für den Kommentar, ich schreibe morgen eine LK- Klausur über dieses Thema und mir hat es wirklich geholfen. Ich lese den Block hier wirklich gerne. 😀

  12. #12 Cornelius Courts
    12/12/2014

    @Freschta: danke für die Rückmeldung und viel Erfolg 🙂

  13. #13 Hannah
    20/09/2017

    Du hast beim Auswerten des Elektropherogramms geschrieben, dass der Mann im “System D10 die Allele 12 und 15, im System vWA die Allele 14 und 16 aufweist .” Aber was genau sind diese Allee eigentlich und warum hat man pro STR – System immer 2 davon ? Aufgrund des diploiden Chromosomensatzes? Ich habe mir zwar deine Erklärungen dazu durchgelesen, aber leider nicht ganz verstanden, warum jetzt aufeinmal innerhalb der STRs wieder von Allelen gesprochen wird.
    Es wäre wirklich sehr nett, wenn mir das nochmal erklärt werden könnte.
    Vielen Dank. Hannah

  14. #14 Cornelius Courts
    21/09/2017

    @Hannah: “Aber was genau sind diese Allee eigentlich”

    Ich kann das nicht besser erklären, als ich es hier schonmal gemacht habe, vielleicht hilft das weiter:

    Auf den Chromosomen eines Paares befinden sich jeweils die gleichen Inhalte (z.B. Gene), die allerdings nicht identisch sein müssen, da je ein Chromosom eines Paares vom Vater und das andere von der Mutter stammt.
    Das ist in etwa so, wie wenn man das gleiche Kochbuch (s. „Restaurantanalogie“) zweimal im Bücherregal stehen hat, aber in unterschiedlichen Ausgaben: die Inhalte stimmen natürlich überein, aber hier und da ist ein Druckfehler, der vielleicht in der anderen Ausgabe korrigiert wurde, die Seitennumerierung ist anders usf. Worauf es ankommt: der Mensch hat von jedem Gen, von jedem DNA-Abschnitt zwei Kopien, je eine auf einem Partner eines Chromosomenpaars. Da die Abschnitte nicht immer auf den Buchstaben genau identisch sind, kann man also von „Ausgaben” oder Varianten der Abschnitte sprechen, das Fachwort ist „Allel”. Die Kombination der beiden Allele eines Abschnitts auf den beiden Partnern eines Chromosomenpaares nennt man „Genotyp”.

    “Aufgrund des diploiden Chromosomensatzes? ”

    Ja. Wie oben erwähnt: Jeder Mensch hat von jedem Gen, von jedem nicht-codierenden DNA-Bereich, von jedem Repeat also auch von jedem STR-System zwei Kopien in seinem Genom: jeweils eine auf jedem Partner eines Chromosomenpaars. Mit anderen Worten: eine Kopie jedes STR-Systems wird von der Mutter vererbt, die andere vom Vater.
    Da nun die Anzahl der Wiederholungseinheiten bei den STR-Systemen von Person zu Person sehr unterschiedlich sein kann (was der Grund ist, warum man sie einsetzt, um damit Personen zu unterscheiden), müssen diese Varianten, oder Allele, eindeutige Bezeichnungen haben. In unserem Beispiel hat der Mann im System vWA das Allel 14 (mit 14 Wiederholungen der Repeateinheit), sagen wir, von seiner Mutter bekommen und das Allel 16 (mit 16 Wiederholungen der Repeateinheit) von seinem Vater.

  15. #15 Hannah
    21/09/2017

    Erst einmal vielen Dank für die schnelle Antwort. Ich habe es (so hoffe ich doch ) jetzt einigermaßen verstanden. Nur um nochmal nachzufragen: Heißt das also, dass jeder Short Tandem Repeat auch einfach als Alles bezeichnet werden kann?
    Außerdem wurde ebenfalls geschrieben, dass manche STR – Systeme nur aus einem Peak bestehen. Tritt das nur auf, wenn von der Mutter und vom Vater die gleiche Anzahl an Wiederholungen vererbt wurde, sprich Homozygotie?

  16. #16 Lena
    Heidelberg
    28/10/2019

    Hallo,
    irgendwo muss ich etwas missverstanden haben, alle STR´s die verwendet werden bestehen aus 4Bp?! Wie können 10 bzw 7 Wiederholungen aus verschiedenen Systemen, beide die Länge 200Bp haben? 10 Wiederholungen müssten doch zum Beispiel immer 40Bp (10X4Bp=40Bp) ergeben, egal in welchem System?

  17. #17 Lena
    28/10/2019

    Ahhh sorry, hat sich erledigt…Geschrieben ohne richtig zu denken!