Die Überschrift ist keine Übertreibung. Das Next Generation Sequencing (NGS), also die nächste Generation der DNA-Sequenzierungstechnologie wird die Genetik, die Evolutionsbiologie und zumindest einen Teil der Medizin revolutionieren. Manche sagen, NGS wird genauso groß wie die PCR und ich halte das nicht für unrealistisch.

Ich behaupte: NGS wird ermöglichen, daß in spätestens 10 Jahren jede/r einen Datensatz seines/ihres kompletten Genoms auf einem USB-Stick oder gar dem Chip seiner/ihrer Krankenkassenkarte immer dabei haben kann.

(Bevor es losgeht: ich empfehle sehr, sich zur Vorbereitung die Basic-Artikel zu DNA und PCR zu Gemüte zu führen)

Um NGS einordnen zu können, muß man zunächst einen Begriff von der DNA-Sequenzierung bekommen:

DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül. Die DNA-Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der Genomik eingeleitet. Seit 1995 konnte durch DNA-Sequenzierung das Genom von über 1000 (Stand: 2010) verschiedenen Organismen analysiert werden […]. Zusammen mit anderen DNA-analytischen Verfahren wird die DNA-Sequenzierung u. a. auch zur Untersuchung genetisch bedingter Erkrankungen herangezogen. Darüber hinaus ist die DNA-Sequenzierung als analytische Schlüsselmethode, insbesondere im Rahmen von DNA-Klonierungen (engl. molecular cloning), aus einem molekularbiologischen bzw. gentechnischen Laborbetrieb, heute nicht mehr wegzudenken.
aus Wikipedia

Die Sequenzierung von DNA ist also das Auslesen der „Buchstaben” der DNA und damit eine notwendige aber nicht ausreichende Voraussetzung, die Funktion, Regulation und Zusammenwirkung von Genen, den „heiligen Gral” der Genetik, zu verstehen. Um z.B. ein englisches Buch verstehen zu können, muß man lesen und Englisch können. Sequenzieren entspräche dabei dem Lesenkönnen und der Unterschied zwischen klassischem „Old-School”-Sequenzieren und NGS wäre in etwa der zwischen einem Erstklässler, der eine halbe Minute für „Fu ruft tut” braucht und einem Stadion voll Anne Jones’ (die mit 4700 Wörtern pro Minute den Rekord im Speedreading hält).

Die „alte” Sequenzierung wurde 1977 von F. Sanger vorgestellt (und 1980 verdientermaßen mit dem Nobel prämiert).
Ihre Technik ist die „Kettenabbruchmethode”: wie bei der PCR wird ein DNA-Strang von einer Polymerase abgelesen und eine komplementäre Kopie davon angefertigt. Auch hier wird zur „Einweisung” der Polymerase ein Primer benötigt. Zu den normalen Bausteinen, die die Polymerase zusammensetzt, den Desoxyribonukleotiden (dNTP), wird dem Reaktionsgemisch aber noch eine bestimmte Menge sogenannter Didesoxyribonukleotide (ddNTP) zugegeben. Diese unterscheiden sich von den normalen Nukleotiden dadurch, daß sie auch am 3′-C-Atom kein Sauerstoffatom tragen und dort also kein weiteres Nukleotid angefügt werden kann.

i-866334a8d8cfd324a821451ab4804cfa-ddntp.jpg

Wenn die Polymerase dann zufällig ein solches ddNTP (s. Bild links) einbaut, so bricht danach die Synthese einfach ab, daher der Name. Bei den modernen Ansätzen der Sanger-Sequenzierung tragen die ddNTPs für die vier Basen der DNA (A, G, C und T) jeweils einen verschiedenen Farbstoff, so daß man sie voneinander unterscheiden kann (zum Beispiel T: rot, G: orange, A: grün, C: blau). Alle vier Arten von ddNTPs werden dann einer Sequenzierungsreaktion beigemischt und zwar genau in einer solchen Menge, daß nicht immer, aber immer mal wieder ein ddNTP statt eines dNTPs eingebaut wird. Das führt dazu, daß nach einer bestimmten Zeit statistisch gesehen an jeder Position eines neu synthetisierten DNA-Stranges mal ein ddNTP eingebaut und dadurch die Kettenverlängerung abgebrochen wird. Kompliziert? Ein Beispiel: Angenommen, wir wollen folgendes unbekanntes DNA-Stück sequenzieren:

XXXXXXXX (jedes X steht für eine noch unbekannte Base, A, G, C oder T)

Wir stellen also einen Sequenzierreaktionsmix her (mit Polymerase, Primer, dNTPs und ddNTPs), geben das unbekannte DNA-Stück dazu und lassen die Reaktion laufen.
Wenn man, wie beschrieben, lange genug wartet, entsteht in unserem Beispiel bei zufälligem Einbau von ddNTPs (dargestellt durch Kleinbuchstaben) an allen möglichen Positionen mit der Zeit eine Mischung folgender Fragmente:

t
Tc
TCg
TCGa
TCGAa
TCGAAt
TCGAATg
TCGAATGc
TCGAATGC (das wäre die vollständige komplementäre Sequenz, die nur dann entsteht, wenn zufällig kein ddNTP eingebaut wird)

Diese Fragmente unterscheiden sich also durch das jeweils eingebaute ddNTP am Ende (und dadurch die Farbe) und ihre Länge. Wenn man nun die Fragmente der Länge nach auftrennt (durch das Verfahren der Elektrophorese, s. auch hier) und gleichzeitig ihre Farbe feststellt, kann man dadurch die Sequenz des ursprünglichen DNA-Stückes rekonstruieren:
vom kürzesten Fragment im Beispiel oben ausgehend in Richtung längere Fragmente erhält man die Sequenz „t c g a a t g c” (man betrachtet immer das letzte Nukleotid). Diese kann man dann nach der Regel t = a, a = t, g = c und c = g in die Sequenz „AGCTTACG” übersetzen und das ist dann unsere gesuchte Sequenz XXXXXXXX.

Dieses Grundprinzip, daß also entlang eines zu sequenzierenden DNA-Stückes eine komplementäre Sequenz synthetisiert und dabei der Einbau durch irgendein Verfahren erkennbarer Nukleotide registriert und anhand der zeitlichen Abfolge der Einbauereignisse die gesuchte Sequenz konstituiert wird, liegt auch den meisten NGS-Verfahren, derer es mehrere teils sehr verschiedene gibt, zugrunde. Ich werde sie hier nicht näher beschreiben, da eine solche Beschreibung zwangsläufig zuviel voraussetzen und sehr technisch und trocken geraten müßte.

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Kommentare (17)

  1. #1 silentjay
    07/03/2012

    Von Zeit zu Zeit wird auch unterschieden zwischen Sanger, Next Generation Sequencing und Third Generation Sequencing.
    Wobei, wenn ich das richtig verstehe, der Unterschied darin besteht, das bei NGS die Auftrennung wegfällt und bei TGS nurnoch der einzelne Strang einmal bei der Replikation beobachtet wird.

    Eine ‘technische’ Übersicht habe ich da mal gefunden .

  2. #2 ZetaOri
    07/03/2012

    Hmmm, …

    Next Generation Sequencing – Die ultimative genetische Technik[…]
    … so daß ein komplettes menschliches Genom mit seinen 3,2 Milliarden Buchstaben, für das das HGP noch 10 Jahre brauchte, inzwischen innerhalb weniger Tage sequenziert werden kann!

    … doch nicht so ‘ultimativ’ : …

    Third Generation Sequencing – Nanoporensequenzierung verspricht menschliches Genom in 15 Minuten

    …?
    Oder habe ich nur irgend etwas nicht verstanden?

  3. #3 Michael
    07/03/2012

    Next Gen Sequencing ist ne coole Sache!

  4. #4 griesl
    08/03/2012

    mehr über die technik 😀
    ich muss mich wahrscheinlich erstmal in die materie, ngs, einlesen um zu verstehen wie man daraus auf histonmodifikationen, konformation und lokalisierung der dna, schliessen kann.
    aber endlich mal ein artikel, der nicht nur genfixiert ist.
    DANKE

    ps. … das suckt schon bei den profs ^^

    Ich fordere mehr Experten, statt Spezialisten 😀

  5. #5 griesl
    08/03/2012

    was ist eigentlich mit siRNA und miRNA, die sicherlich auch nicht unbedeutend sind.

  6. #6 Cornelius Courts
    08/03/2012

    @Zeta: mit “ultimativ” meinte ich nicht, daß danach nichts mehr kommen würde, sondern daß NGS endgültig das Genom erschlossen hat: seit NGS ist es möglich, das Genom eines Menschen in kurzer Zeit vollständig und zu sehr günstigem Preis zu sequenzieren.
    Das ist die eigentliche Landmarke. Dinge wie Nano-Seq. sind da nur noch kleine Verbesserungen, die keine große Sensation mehr sind.
    Und die Genetik ist natürlich nach NGS auch nicht “arbeitslos”. Im Gegenteil! Durch NGS wird man endlich ganz neue Fragen bearbeiten können. Die Arbeit fängt jetzt erst richtig an :-)

    @griesl: “was ist eigentlich mit siRNA und miRNA, die sicherlich auch nicht unbedeutend sind. ”
    Hehe, wem sagst Du das? Mich muß man sicher nicht mehr von der Bedeutung der miRNA überzeugen 😉
    http://www.scienceblogs.de/bloodnacid/2012/02/micrornasignaturen-zur-identifizierung-von-spurenarten.php

  7. #7 Cornelius Courts
    08/03/2012

    @silentjay: “Eine ‘technische’ Übersicht habe ich da mal gefunden.”

    Auch diese Übersicht ist nicht vollständig und nennt nicht alle Ansätze für nennen wir es mal “neue” Sequenzierungstechniken. Die Unterteilung in “Next” und “Third” ist dabei zudem willkürlich und ich fasse “Single Molecule”- und “RealTime”-Sequencing durchaus auch unter NGS zusammen. Der Unterschied zwischen diesen Verfahren ist gering n (15 Minuten zu 3-5 Tage) und qualitativ zu vernachlässigen im Vergleich zum ungeheuren Sprung von Sanger zu NGS.
    Es wird jetzt sicher bald einen “Formatwettbewerb” geben, wo sich ein oder mehrere NGS-Techniken und damit ein oder mehrere Hersteller durchsetzen werden und wenn diese Geräte dann erst die Kinderkrankheiten los und halbwegs erschwinglich sind oder erste NGS-Service-Anbieter auf den Markt gehen, dann wird es richtig abgehen.

  8. #8 Michael
    08/03/2012

    Der “heilige Gral” in dem Bereich ist es, ein (humanes) Genom für 1000$ zu sequenzieren, davon ist man nicht mehr sehr weit weg.
    Das Problem ist aber mittlerweile nicht mehr die Erzeugung, sondern die Auswertung und Interpretation der Daten. Das 1000-Genomesprojekt hat da einiges gezeigt – so hat man mittlerweile gut 15 Mio SNPs entdeckt, wenn ich mich jetzt richtig erinnere. Das Problem hierbei ist aber, diese SNPs jetzt zu Risiken oder Funktionen (bzw. deren Änderungen) zuzuordnen. Und das ist besonders bei seltenen SNPs (die höchstens in 0,1% der Fälle gefunden werden) schwierig.

  9. #9 Cornelius Courts
    08/03/2012

    @Michael: “Das Problem ist aber mittlerweile nicht mehr die Erzeugung, sondern die Auswertung und Interpretation der Daten.”
    Ganz genau. Und das ist es auch, was ich meinte: die Arbeit fängt jetzt erst richtig an. Und selbst wenn man alle Gene und SNPs etc. zuordnen kann, ist man noch lange nicht fertig.
    Es ist wie immer in der Wissenschaft: jede Antwort wirft neue Fragen auf und NGS potenziert dieses Phänomen einfach nur.

  10. #10 Jan
    08/03/2012

    Hallo und danke für den informativen Beitrag,

    welche Methode ist denn die aktuelle NGS?
    Ich kenne (als Biologie Student) nur Pyrosequencing oder Sequenzierung mit reversiblen
    Terminatoren. Sind diese denn schon veraltet?

    Schöne Grüße,
    Jan

  11. #11 Cornelius Courts
    08/03/2012

    @Jan: “Ich kenne (als Biologie Student) nur Pyrosequencing oder Sequenzierung mit reversiblen Terminatoren. Sind diese denn schon veraltet?”

    Es gibt noch nicht DIE Methode, also einen bestimmten Standard. Pyrosequenzierung wird durchaus noch gemacht (Illumina mit ihrem 454er). Die “neuesten” Methoden sind single-molecule-real-time Sequencing (Fa. Pacific Biosciences) oder nanopore-Sequencing (Fa. Oxford Nanopore), die beide ohne vorherige Amplifikation auskommen.

  12. #12 StrangerInAStrangeLand
    09/03/2012

    @Cornelius

    “Es gibt noch nicht DIE Methode, also einen bestimmten Standard. Pyrosequenzierung wird durchaus noch gemacht (Illumina mit ihrem 454er).”

    Da schmeist Du zwei verschiedene Sachen zusammen, das Solexa/Illumina System, das auf “sequencing by synthesis” beruht, und die pyrosequencing Methode von 454 Life Sciences (jetzt Roche). Ein drittes System ist auch noch verbreitet, das SOLiD von Applied Biosystems (sequencing by ligation). Alle diese Dinger haben ihre Vor-und Nachteile, z.B. erreicht man mit 454 sequencing relativ lange Leseweiten (mit unserer Maschine inzwischen 400-700 bp), was wir für die die Sequenzierung von Umweltproben auch brauchen. Die Solexa & SOLiD Geräte produzieren dagegen nur kurze Stücke (25-50 bp), was eine komplexere Bioinformatik notwendig macht und für taxonomische Analysen ungeeignet ist, aber davon solche Mengen, daß die Kosten pro Base deutlich geringer sind als bei 454. Für Genomsequenzierungen wie Du sie beschreibst, besonders wenn bereits Referenzgenome wie beim Menschen vorliegen, sind diese Techniken also normalerweise besser.

    Ich würde aber auch sagen, daß die “third generation” noch einmal ein wichtiger Schritt vorwärts ist, denn ohne die Notwendigkeit eines Amplifikationsschritts (und des ärgerlichen PCR-Bias) ist die Möglichkeit gegeben, die Sequenzen quantitativ auszuwerten. Das mag zwar für Genomsequenzierungen nicht entscheidend sein, aber für die Analyse von Umweltproben wäre dies fantastisch – nicht nur zu sagen welche Bakterien beispielweise in einer Probe sind, sondern auch wie viele.

  13. #13 Bioinformatikerin
    13/11/2012

    @Cornelius:
    Der Text hier klingt mehr nach Propaganda, als dass er den Leser über NGS informiert. Ich bin in der Bioinformatik tätig und nach dem Lesen genauso schlau wie vorher :/
    Was die Politik angeht, so solltest du eventuell deine Oberflächlichkeit mal ablegen und hinter den Vorhang schauen. Eventuell versuchen die kleinen Politiker die Menschen vor etwas zu beschützen. Hochentwickelte Humangenetik in den falschen Händen kann riesigen Schaden anrichten. Darüber sollte sich JEDER Wissenschaftler, der damit zu tun hat, im Klaren sein. Dieser Aspekt fehlt bei deiner Lobrede über NGS komplett.

    • #14 Cornelius Courts
      13/11/2012

      @Bioinformatikerin:

      “Der Text hier klingt mehr nach Propaganda, als dass er den Leser über NGS informiert.”

      Propaganda? Wofür? Heißt Propaganda begeistert zu sein von einer verbesserten Sequenziermethode mit grandiosen neuen Möglichkeiten (s.z.B. http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)? Jup, dann ist das wohl Propaganda.
      Ansonsten ist Deine “Kritik” völlig gegenstandslos und einfältig. Welche Deiner unerheblichen Auffassung zufolge wichtige Information über NGS habe ich denn vorenthalten?

      “Eventuell versuchen die kleinen Politiker die Menschen vor etwas zu beschützen.”

      Ernsthaft jetzt? Das soll ein Argument sein? Die klugen Politiker wissen bestimmt am besten, welche wissenschaftlichen Errungenschaften (die sie nicht mal im Ansatz verstehen) gut für uns dummes Volk sind und sie wollen uns beschützen? Ich finde ja, man hätte beizeiten den Computer verbieten sollen! Was da alles schon schlimmes mit gemacht worden ist, nee nee nee!
      Bist Du sicher, daß Du Bioinformatikerin bist oder beschränkt sich Deine Tätigkeit dort doch eher auf Druckerpapier nachfüllen?

      “Hochentwickelte Humangenetik in den falschen Händen kann riesigen Schaden anrichten.”

      Ähem…NGS verhält sich zu Humangenetik wie eine Strasse zu Autos. Nicht nur die Humangenetik profitiert von NGS, weißt Du?
      Und von welchem “Schaden” schwadronierst Du hier? Was ernst gemeintes oder etwas, was Du in GATTACA und Konsorten gesehen und ein bißchen zu ernst genommen hast?

      “Dieser Aspekt fehlt bei deiner Lobrede über NGS komplett.”

      Echt? Mir war so, als hätte ich einen langen Textteil zu “Probleme und Einschränkungen” geschrieben, in dem ich ausführlich auf medizinische und datenschutzrechtliche Herausforderungen des NGS eingehe, aber vielleicht täusche ich mich auch.

  14. #15 Bloody Mary
    13/11/2012

    “solltest du eventuell deine Oberflächlichkeit mal ablegen und hinter den Vorhang schauen”

    Och menno, Cornelius, wieso magst Du denn nicht hinter den Vorhang schauen?

    Folgende Bioinformatiker-Seite erklärt Dir, warum:
    “Wer hinter den Vorhang sehen will muss erst lernen, verstehen und die Dualität meistern und bereit sein, dem Göttlichen zu dienen (Priesterschaft). Wer also Gott dient und nicht sich selbst wird in die Geheimnisse eingeweiht.”
    http://www.wegeinslicht.net/magie-mystik/tarot/grosse-arkana/

  15. #16 Cornelius Courts
    13/11/2012

    @BloodyMary:
    ach soooooo. Na, dann kann ja nichts mehr aus mir altem vorhangsbeschränktem, oberflächendümpelndem, tellerrandüberragtem NGS-Propagandisten werden!
    Man weiß ja: hochgewickelte Humangardinik kann riesigen Schaden anrichten. Da kann man ja aNGSt bekommen… 😉

  16. #17 Marisol Sanchis
    03/06/2016

    Me encanta el delineado, es la forma de que los ojos no queden escondidos tras las gafas. Un besitoel blog de Sunika