Elongationsphase
Neben der DNA-Vorlage (meist genomische DNA) und den Primern befindet sich auch DNA-Pol. im Reaktionsgemisch. Diese benötigt, wie gesagt, ein freies DNA-Ende, um mit ihrer Arbeit beginnen zu können und diese Enden bieten die Primer ihr an. Die Orientierung des Primers (Pfeilspitze) gibt ihr auch die Richtung vor, in der sie kopieren muß, sie kann also nicht in die „falsche” Richtung kopieren. Die DNA-Pol. setzt am richtigen Ende des Primers an und beginnt von dort aus, eine Kopie des Vorlagenstrangs anzufertigen. Das gleiche passiert auf dem anderen der beiden DNA-Stränge. Die Elongationsphase läuft dabei bei der optimalen Arbeitstemperatur für die DNA-Pol ab. Diese liegt bei den „modernen” Polymerasen meist bei um die 72°C. „Moderne” DNA-Polymerasen haben die Durchführung der PCR stark vereinfacht, denn sie stammen aus hitzeresistenten Organismen (z.B. dem Bakterium Thermus aquaticus, abgekürzt „Taq”) und werden durch die Denaturierungstemperatur von 95°C nicht zerstört, wie z.B. die menschliche DNA-Polymerase. Das hat den großen Vorteil, daß man nicht mehr, wie früher, als man noch keine „Taq-Polymerase” hatte, nach jeder Denaturierungsphase die zerstörte Polymerase ersetzen muß, was Zeit und Arbeit spart und das Kontaminationsrisiko drastisch senkt.
Die Elongationsphase muß so lange dauern, wie die Polymerase braucht, um den Ziel-DNA-Abschnitt zu kopieren. Man rechnet etwa 1 Minute pro 1000 Basenpaare (Buchstaben).
Am Ende der Phase liegen also Kopien der Ziel-DNA-Abschnitte vor, in die die Primer eingebaut wurden und die wiederum die Bindestelle für den jeweils anderen Primer enthalten, die also als Vorlagen für einen neuen Zyklus geeignet sind. Die Kopien bilden nun wieder einen Doppelstrang mit der Vorlage, der zugleich als Ausgangssituation für den nächsten Zyklus dient.
Zusammenfassung eines Zyklus’:
Dann wird denaturiert (95°C) und danach beginnt:
Danach wird die Temperatur erhöht (72°C) und die Elongation beginnt.
Und noch einmal: Denaturierung, dann Temperatur senken…
Und noch einmal: die Temperatur wird erhöht und die Elongation läuft ab.
Und so weiter. Nach etwa 30 Wiederholungen ist ausreichend Produkt entstanden und die PCR ist fertig.
Das Coole ist, daß sich die drei Phasen von „außen” nur durch die Temperatur, der man das Reaktionsgemisch aussetzt, unterscheiden. Genau das ermöglicht es auch, die PCR in sog. Thermocyclern, also programmierbaren, sehr schnell aufheizenden und abkühlenden „Mini-Öfen” durchzuführen.
Vorher pipettiert man ein vollständiges Reaktionsgemisch zusammen. Es besteht aus
- Puffer (eine wäßrige Lösung von bestimmten Salzen, z.B. Magnesiumchlorid (MgCl2), die eine optimale „Umgebung” für die Polymerase bietet)
- zwei Primern
- Nukleotiden (die Bausteine der DNA, aus denen die Polymerase einen neuen DNA-Strang synthetisiert)
- DNA-Vorlage (die DNA, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält)
- DNA-Polymerase
und ein typisches Endvolumen ist 25 – 50 µl. Dann stellt man es in den vorprogrammierten Thermocycler, startet das Programm und kann die PCR sich selbst überlassen. Eine PCR mit 30 Zyklen dauert so nur ca. 2-3 Stunden. Und so sieht das Thermoprofil einer klassischen PCR aus:
Ich begnüge mich hier mit den Grundlagen der PCR. Es gibt dicke Bücher, die sich nur mit PCR, ihrer Optimierung, ihren Beschränkungen und Varianten befassen. Ein spannendes Thema ist zum Beispiel die Effizienz einer PCR. Wie schon erwähnt, wird in der Praxis nie eine Effizienz von 100% erreicht. D.h. nur theoretisch verläuft die Amplifikation gemäß der Formel
mit
Xn = Menge des Amplifikates nach n Zyklen
X0 = Ausgangsmenge
n = Anzahl der Zyklen
Der realistische Wert ist
wobei E für die Effizienz der PCR steht, die zwischen 0 und 1 liegen kann und für einige PCR-Varianten ist die genaue Kenntnis der Effizienz entscheidend. Wovon die Effizienz einer PCR abhängt und wie sie gemessen werden kann, wäre zwar mindestens einen eigenen Beitrag wert, ist aber für das Verständnis der PCR nicht entscheidend.
Warum erzähle ich das alles überhaupt?
Die PCR (in ihrer „Standard”-Ausführung aber auch in vielen verschiedenen Varianten) ist auch für die forensische Genetik absolut zentral und unverzichtbar. Durch die PCR war es möglich, die unzureichende RFLP-Methode früherer Tage durch die aktuell gebräuchliche STR-Methode (hierzu später mehr) zu ersetzen. Nur dadurch können wir heute DNA hochgenau quantifizieren und selbst aus den minimalen Spuren an manchen Tatorten noch genug Ziel-DNA-Abschnitte herstellen, um daraus ein DNA-Profil zu erzeugen.
Kommentare (39)