In der letzten Folge habe ich über Spurenkunde berichtet und erklärt, daß es wichtig ist, eine biologische Spur, aus der man DNA für die Herstellung eines DNA-Profils gewinnen möchte, genau zu charakterisieren.

In diesem Beitrag beschreibe ich, wie es gelingt, DNA aus den Zellen einer biologischen Spur zu isolieren. Wir streben dabei immer drei Ziele an: a) ausreichende Menge, b) ausreichende Integrität, c) ausreichende Sauberkeit.


a) Ist eine gewisse Mindestmenge an DNA nicht vorhanden, können wir kein solides und reproduzierbares DNA-Profil erstellen. Wir benötigen mindestens 50 pg DNA, um sicher zu sein. Ein Picogramm (pg) ist der tausendste Teil eines millionstel Milligramm – unvorstellbar wenig also und doch reicht die DNA in einer Spur manchmal nicht aus. Eine gute Aufreinigung muß eine möglichst hohe Ausbeute an DNA liefern, insbesondere, weil manche Spuren so klein sind, daß wir nur einen „Schuß” haben und alles auf eine Karte setzen müssen, um ausreichend DNA gewinnen zu können.

b) DNA ist zwar tough aber nicht unzerstörbar. Sie kann „kaputt” gehen, d.h. der Doppelstrang kann zerbrechen und ab einem bestimmten Fraktionierungsgrad taugt die DNA nicht mehr für die bei der Profilerstellung eingesetzte PCR-Amplifikation (warum erzähle ich später). Eine gute Aufreinigung muß möglichst intakte DNA liefern darf aber zumindest die DNA nicht noch weiter zerstören.

c) Manche Spuren sind extrem „siffig”, d.h. mit allen möglichen Umwelteinflüssen und/oder Chemikalien verunreinigt; man denke an Blut, das sich in einer Lache von Erbrochenem befindet oder auf einem mit psychedelischen Farben getünchten Jeansbeinkleid. In beiden Fällen kann die Spur mit Stoffen vermengt sein, sog. „Inhibitoren”, die die Effizienz oder Performance einer nachfolgenden chemischen Reaktion wie der PCR (s.o.) reduzieren, teils so stark, daß ein DNA-Profil gar nicht mehr gelingt. Eine gute Aufreinigung muß möglichst alle Inhibitoren aus der Präparation entfernen.

Es gibt eine Fülle an DNA-Isolationsmethoden und zig Firmen preisen ihr jeweiliges DNA-Extraktions-Kit – so nennt man eine gebrauchsfertige, praktische Zusammenstellung aller Chemikalien und sonstiger spezieller Vebrauchsmaterialien, die man für eine bestimmte Arbeit, z.B. eine DNA-Extraktion, benötigt (hier ein Beispiel) – als das beste an. Inzwischen gibt es auch zahlreiche, speziell auf forensischen Bedarf zugeschnittene Kits und Methoden.
Die Hersteller wissen natürlich, daß alle Methoden, die wir einsetzen, den drei oben genannten Ansprüchen genügen müssen und die meisten Kits leisten das auch. Sie unterscheiden sich daher vor allem in der grundlegenden Methode, der Bearbeitungszeit, der „Handhabbarkeit” und – ein wichtiger Faktor – dem Preis.

Man unterscheidet mehrere „grundlegende Methoden” denen jedoch allen gemein ist, daß das Ziel aller Extraktionsbemühungen immer ist, aus der extrem komplexen Mischung von Molekülen und Stoffen aus einer biologischen Spur, die nicht nur alle möglichen Verunreinigungen aus der Umwelt sondern auch für die angestrebte Analyse nutzlose oder gar beeinträchtigende Zellbestandteile enthält, möglichst ausschließlich DNA herauszufiltern.
Die folgende Tabelle stellt die bekanntesten Methoden vor:

Die organische i-0df24605087d9f046975312ed81247ed-01 tabelle.jpgMethode beruht auf einer Phasentrennung (organische und wäßrige Phase) durch Zentrifugation mit der sehr wirksam DNA von Proteinen, Lipiden und sonstigem Zellschrott getrennt wird. Sie wird nicht mehr so oft (und gerne) verwendet, hauptsächlich, weil man dafür eine eigene Abzugshaube („Abzug”) benötigt, um überhaupt mit dem sehr giftigen und ätzenden Phenol und dem leicht flüchtigen Chloroform arbeiten zu dürfen. Zudem ist sie langwierig, durch zahlreiche Gefäßwechsel kontaminationsanfällig und nicht automatisierbar.

Die Kochlyse mit dem Chelatbildner Chelex® beruht auf darauf, die Zellen durch das Kochen der Extraktionsmischung „aufzuknacken” und dann mittels der Chelex-Chemikalie die zweiwertigen Kationen wegzuschnappen, die die DNA-zerstörenden Enzyme, die beim Aufknacken der Zellen freigesetzt werden, benötigen, um zu funktionieren. Die Methode geht durch das Kochen sehr „ruppig” mit der DNA um und ist eine „quick&dirty”-Technik, die man in der Analyse von möglicherweise empfindlichem Spurenmaterial eigentlich nicht einsetzt, um nicht Gefahr zu laufen, die DNA aus der Spur vollends unbrauchbar zu machen. Die Kochlyse findet aber noch regelmäßig Anwendung in der Abstammungsbegutachtung, wo man „frische” DNA aus einer Mundschleimhautprobe bearbeitet, für welche eine solche schnelle und brutale Extraktion recht gut geeignet ist. Zudem finden alle Schritte in einem einzigen Reaktionsgefäß statt und somit besteht durch das Entfallen von Transfers kaum Gefahr einer Kontamination. Man muß jedoch bedenken, daß die DNA nach der Kochlyse einzelsträngig vorliegt und daher ungeeignet für nachfolgende Analysen ist, die eine doppelsträngige DNA voraussetzen.

Die Silica-Membran-Methode ist die für Spurenuntersuchungen am besten geeignete Methode, da sie saubere DNA liefert, einen schonenden Umgang mit dem Material erlaubt und bei hohem Arbeitsaufkommen auch von einem Roboter durchgeführt werden kann. Sie beruht darauf, daß DNA in Gegenwart von hoch konzentrierten chaotropen Salzen reversibel an Silica (= Siliziumdioxid, SiO2) bindet. Die Zellen aus der Spur werden zunächst chemisch und durch Zugabe von Proteinase K, einem proteinspaltenden Enzym, aufgebrochen. Das Gemisch wird dann mit chaotropen Salzen versetzt und auf eine unbewegliche Silica-Membran gegeben, an die die DNA-Moleküle dann fest binden. Jetzt kann man den Zellschrott und sonstige Moleküle (unter Beibehaltung der Salzkonzentration) wegwaschen, bis am Ende nur noch die DNA an der Membran „klebt”. Indem man zum Schluß mit einer Lösung spült, die keine chaotropen Salze mehr enthält, löst sich die Bindung der DNA an der Membran, sie wird freigesetzt und ist nun schön sauber für die nächsten Schritte verfügbar. Fast alle kommerziell erhältlichen Kits verwenden eine Modifikation der Silica-Methode, die zum Teil sehr stark abgewandelt wird.
Ein Beispiel dafür sind Magnetkügelchen („magnetic beads”), die bei den forensischen Kits sehr beliebt sind, weil sie sehr saubere DNA hervorbringen.

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Kommentare (22)

  1. #1 Muddi & theBlowfish
    29/03/2011

    Grosses Lob,
    gut verständlich, gut gegliedert (Jaaaa, Absätze:-)) )
    spannend geschrieben.
    Man/frau/trisexuelleswesenausdempferdekopfnebel freut sich schon auf den nächsten Beitrag!

  2. #2 Skrazor
    29/03/2011

    Wieder mal ein ausgezeichneter Artikel! (mit dem du dieses Mal sogar die Absatz-Freunde zufriedengestellt hast ^^)

    Kann den nächsten Teil kaum erwarten 😀

  3. #3 CCS
    29/03/2011

    Sehr schöner Beitrag!

    Ein paar Fragen:
    Ist Chelex besser as EDTA?
    Was sind denn Beispiele für häufige Inhibitoren?
    Mir wurde mal erzählt, DNA sei ein hydrophobes Molekül, dass sich durch die Hydrathülle hydrophil verhält, kennst du da irgend eine erklärende Quelle zu?

    Mir gefällt der Blog bisher sehr!

  4. #4 DerHirntot
    29/03/2011

    Toller Beitrag zu einer tollen Serie.

    Ein paar Fragen: Benutzt ihr den verlinkten Papillo-Check-Extraktionskit? Der ist ja eher forensik-fremd.
    Welche Geräte benutzt ihr zur Extraktion?

  5. #5 DerHirntot
    29/03/2011

    @CCS: Aus Erfahrung bekannt sind mir als Inhibitoren beispielsweise einige (besonders lokale) Antibiotika, Heparin, das oben schon genannte Hämoglobin und massive Schleimbeimengungen im Probenmaterial.

  6. #6 Cornelius Courts
    30/03/2011

    @Fragen:
    – Ist Chelex besser as EDTA?
    Ja, denn es gestattet eine einfache Entfernung des Chelatbildners aus der Lösung (sonst würde nachher die PCR nicht mehr laufen)
    – Was sind denn Beispiele für häufige Inhibitoren?
    z.B. Gallensalze (in Stuhl), Kollagen (in Geweben), Immunglobulin G (in Blut), Harnstoff (in Urin), Melanin (Haare, Haut), Huminsäure (Erde, Pflanzenmaterial)
    – Mir wurde mal erzählt, DNA sei ein hydrophobes Molekül, dass sich durch die Hydrathülle hydrophil verhält, kennst du da irgend eine erklärende Quelle zu?
    Das ist ziemlich kompliziert und ich habe da auch keine gute Quelle zu. Für das Verhalten von DNA spielen jedenfalls nicht nur die H-Brücken eine Rolle, sondern auch die London-Kräfte und der hydrophobe Effekt (base stacking)…
    – Benutzt ihr den verlinkten Papillo-Check-Extraktionskit? Der ist ja eher forensik-fremd.
    Richtig, das Ding ist nur ein Beispiel für ein “Kit” (Weil es so schön typisch aussieht) und wir benutzen es auch nicht. Firmen, die speziell auch forensischen Bedarf bedienen, sind z.B. Applied Biosystems, Qiagen und Promega
    – Welche Geräte benutzt ihr zur Extraktion?
    Keine Roboter, wir extrahieren manuell. Daher nur die klassischen Kleingeräte: Tischzentrifugen, Heizrüttler, Vortices

  7. #7 PaulS
    30/03/2011

    Wie lange ist denn die DNA unter den durchschnittlichen Bedinungen eines Tatorts haltbar? Muss man so schnell wie möglich noch ne Schicht schieben oder kann man die Probe vielleicht in den meisten Fällen gemütlich einfrieren und weiterarbeiten, wenn zB Kapazitäten im Lab wieder frei sind?

  8. #8 engeltr
    30/03/2011

    Und wieviel kostet so ein Kit? *unschuldig schau*

  9. #9 Cornelius Courts
    31/03/2011

    @Fragen:
    – Wie lange ist denn die DNA unter den durchschnittlichen Bedinungen eines Tatorts haltbar?
    Ganz unterschiedlich. Es kommt natürlich auf die Bedingungen und den Tatort an. Ist der Tatort in einem Raum, ist er nicht der Witterung ausgesetzt, das ist natürlich günstiger, als ein Tatort in einem Wald. Grundsätzlich gilt: feucht ist schlecht, warm ist nicht so toll, viel “Verkehr” (Menschen, Tiere, Sensationen) ist schlecht. Dennoch ist DNA, wenn man sie gut trocknet oder z.B. aus einem getrockneten Blutfleck an der Wand, recht lange recht gut haltbar.
    – Muss man so schnell wie möglich noch ne Schicht schieben?
    Jedenfalls so gut wie nie wegen möglicherweise “ablaufender” Haltbarkeit. In den allermeisten Fällen muß ein DNA-Beweis auch nicht unverzüglich her (das geht, wie gesagt, auch gar nicht so schnell). Es kommt aber (selten) mal vor, daß es doch rasch gehen muß, weil z.B. ein Tatverdächtiger mit Verdunklungsgefahr nicht länger als eine bestimmte Zeit festgehalten werden kann.
    – Und wieviel kostet so ein Kit?
    Oh, völlig unterschiedlich. Ein “klassisches” DNA-Extraktions-Kit einer bekannten Firma kostet z.B. 150 € für 50 Anwendungen.

  10. #10 Mamasliebling
    31/03/2011

    “In den allermeisten Fällen muß ein DNA-Beweis auch nicht unverzüglich her (das geht, wie gesagt, auch gar nicht so schnell)”

    Wie lange dauert eine Untersuchung von Wattestäbchen auf den Tisch bekommen bis zur Fertigung des Gutachtens, wenn du nur die eine Probe zu bearbeiten hättest?

  11. #11 Cornelius Courts
    01/04/2011

    “Wie lange dauert eine Untersuchung von Wattestäbchen auf den Tisch bekommen bis zur Fertigung des Gutachtens, wenn du nur die eine Probe zu bearbeiten hättest?”

    Auch das kommt darauf an, ob der ganze Prozess in den normalen Tagesablauf eingegliedert (mit Essen, Schlafen etc.) oder ob gnadenlos durchgeschrubbt wird.
    Im ersten Fall dauert es, wenn man nichts anderes macht, 3 Arbeitstage (einschl. der vorgeschriebenen Wiederholung), im zweiten Fall ca. 1,5 Tage

  12. #12 Markus
    03/04/2011

    Ich finde , oh schreck und hoffe du rennst nicht davon CSI eine gute Serie. Nur durch deien Arbeit und deine asuführliche Beschreibung der nötigen Arbeit und auch mal zuzugeben das nur “1” Versuch möglich ist finde ich Super. Du hast mich zum kritischen Nachdenken und auf eine neue Perspektive gebracht.
    Nicht das ich wieder auf diese bescheuerte CSI absteuere aber Fragen hab ich natürlich schon noch.. Man zeigt ja schön das eine DNA nach einer Chlor putzerei völlig zerstört ist. was ist die realität dazu?
    Ich habe natürlich auch noch die Sache der Sperma und Vaginal sache mit Grossen Intresse durchgelesen. Was ist dan aber zu tun wenn es eine Vergewaltigung mit MassenOpfer zu tun hat?? Kann man da die Grenzen noch Ziehen??

  13. #13 Cornelius Courts
    04/04/2011

    @MArkus: ich versuche mal, Deine Fragen zu beantworten:
    1.) Ja, Chlorbleiche ist ziemlich schlecht für die DNA-Integrität. Da das Zeug billig und in großen Flaschen erhältlich ist…
    2.) Ich nehme an, mit Massenopfer meinst Du eine Frau, die von gleich mehreren Männern vergewaltigt worden ist? Die Aufklärung eines solchen Falles ist schwierig und häufig nicht eindeutig zu lösen; sie wird umso schwieriger, je mehr Männer es waren. Man würde in einem solchen Fall nicht nur mit den Standard-DNA-Profilen sondern auch mit den Y-Chromosomen, die Haplotypen sind, arbeiten. Zudem gibt es ein ganz neues Verfahren, das für genau solche Fälle taugen würde: haplotypenspezifische Extraktion.

  14. #14 Markus
    04/04/2011

    Hallo Cornelius.. Danke für deine Aanwort. Und obwohl ich andeutungen zu CSI gemacht habe. Wenn ich dich noch bischen wegen der Chlorbleiche Nerven darf. Ist es den so das die Menge Entscheidend ist oder braucht es nur kleinste Menge. Die annahme ist ja das die Bleiche den DNA strang zerstört und du dan nichts mehr anfangen kannst, oder?
    2. Habe dein Vorgeschlagenes Verfahren Gegoogelt, genau 3 PDF formate gefunden. Kanst du das eventuell mal Vereinfacht erklärten.

  15. #15 CCS
    05/04/2011

    Danke für die Antworten!

  16. #16 CCS
    23/08/2011

    Ich habe gelesen, dass Bananen verglichen mit Krokodilen grüner sind als in der Nacht!

    Ist das Spam, willst du wirklich etwas oder ist das ein ausgezeichneter Trollversuch?

  17. #17 Cornelius Courts
    24/08/2011

    Anmerkung: Kommentar von “André Zeiger” wurde als Spam gelöscht

  18. #18 Nicolas
    06/10/2011

    Danke vielmals für die sehr verständliche Erklärung der Extraktionsmethode mit magnetic beads.
    Ich werde diesen Herbst meine Gymnasium Abschlussarbeit zur DNA Analyse abschliessen (Letzten Frühling hatte ich in einem Labor Gelegenheit alles praktisch zu erfahren, dabei kamen auch die magnetic beads zum Zuge) und suchte bereits intensiv im Internet nach Erklärungen dazu. Jedoch war ich sehr verwundert, dass es doch verhältnissmässig zu anderen Themen nur sehr spärliche Berichte gab, und wenn dann war die Herkunft des Wissens völlig undurchsichtig.
    Ich hoffe ich darf in meiner Arbeit ausserdem ihre Grafik zu den magnetic beads verwenden..? (natürlich mit korrekter Quellenangabe)
    Gruss

  19. #19 Cornelius Courts
    06/10/2011

    @Nicolas: Danke für’s Feedback :-)

    “Ich hoffe ich darf in meiner Arbeit ausserdem ihre Grafik zu den magnetic beads verwenden..? (natürlich mit korrekter Quellenangabe)”
    Klar.

  20. #20 Arianna
    08/11/2013

    Ich komme aus der Schweiz und schreibe gerade meine Maturaarbeit über kriminaltechnische Spuren.
    Sehr gut wie du hier alles beschrieben hast, hast mir sehr geholfen. :)
    Hab da mal eine frage und zwar, ob man denn diese Extraktionsmethoden, die do oben beschreibst, für alle Spurenarten verwenden kann. Also egal ob es Speichel, Blut, Sperma etc. ist?

  21. #21 Cornelius Courts
    09/11/2013

    @Arianna: danke für die Rückmeldung und gut zu wissen, daß der Artikel hilfreich war.
    Man kann grob gesagt alle Methoden für alle Spuren einsetzen, weil es ja letztlich nur darum geht, die Zellen zu knacken und die DNA freizusetzen. In der Praxis versucht man aber, seine Methode auf die Spur, mit der man es zu tun hat, anzupassen. Speziell bei Mischspuren z.B. nach Sexualdelikten kann es nötig sein, die “differentielle Lyse” einzusetzen. Bei Spuren aus Geweben muß man meist noch eine Homogenisierung oder Zerkleinerung vorschalten. Außerdem gibt es bei verschiedenen Spurenarten (Knochen, Zähne) auch ganz andere Methoden, s. z.B. hier: http://scienceblogs.de/bloodnacid/2011/06/08/der-knochen-aus-der-tiefe/

  22. #22 Hartmut Dols
    77933 Lahr
    29/02/2016

    Sehr geehrte Damen und Herren,
    wir haben folgendes Problem: Eine Kollegin spuckt uns
    vermutlich auf die Tüten, in denen wir Backwaren ausfahren, um uns zu diskriminieren. Unsere Frage:
    Kann man anhand des getrockneten Speichels auf der
    Papiertüte feststellen, ob es sich a) um menschlichen Speichel handelt und b) reicht dies aus, um ggfs. einen DNA-Test durchzuführen?
    Für eine Antwort wären wir Ihnen sehr dankbar.
    Mit freundlichen Grüßen
    Hartmut Dols