In der letzten Folge haben wir bei einem Ausflug ins Genom die kurzen DNA-Abschnitte short tandem repeats (STR) kennengelernt und ich habe gezeigt, wie und warum man sie für die Erstellung eines DNA-Profils benutzen kann.

In dieser Folge erkläre ich, wie man bis zu 16 STR-Systeme gleichzeitig mittels Multiplex-PCR vervielfältigen kann und wie der Cocktail aus verschiedenen DNA-Schnipseln durch Kapillarelektrophorese sortiert wird. (Ich empfehle dringend, sich vorher ein wenig über die PCR zu erkundigen.)


STR sind also unsere Zielsequenzen: die Kombination der Genotypen seiner STR-Systeme ist für jeden Menschen einzigartig (Ausnahme: eineiige Zwillinge). Aber wie stellt man fest, welchen Genotyp, also welche Allelkombinationen ein Mensch für seine verschiedenen STR-Systeme aufweist?
Zunächst einmal müssen wir genug Kopien der STR-Bereiche haben, um überhaupt damit arbeiten zu können. Im Falle einer sehr geringen Spurenmenge, z.B. einigen wenigen Hautzellen, die ein Täter an einem Messergriff hinterlassen hat, reicht das vorhandene Material für eine direkte Untersuchung der STR nicht annähernd aus und außerdem stört dabei auch der ganze Rest des normalen zellulären Genoms, das wir gar nicht anschauen wollen (und dürfen – s. StPO §81).
Eine kleine Analogie: ein Jahrmarktkünstler hat den ganzen Brockhaus (Genom) auf ein Reiskorn (Spurenträger) geschrieben und gibt uns das Korn. Wir sind aber nur interessiert an den 16 Einträgen über die deutschen Bundesländer (16 STR-Systeme), die über den ganzen Brockhaus verteilt sind. Da wir nur das eine Korn haben und nur einen Versuch, nehmen wir eine ganz starke Lupe und Papier und Stift zur Hand, vergrößern die Abschnitte die uns interessieren und schreiben sie jeweils auf ein Blatt Papier (PCR). Mit den 16 abgeschriebenen Seiten, die sich so leicht handhaben, ablesen und vervielfältigen lassen, können wir nun problemlos weiterarbeiten.

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Die Abbildung zeigt die Verteilung der 13 STR-Systeme der amerikanischen CODIS über die einzelenen Chromosomen: überall im Genom finden sich STR-Systeme.

Um mit möglichst wenig DNA zurecht zu kommen und so auch materialarme Spuren bearbeiten zu können, wurden für die gleichzeitige Anreicherung von derzeit bis zu 16 STR-Systemen „Multiplex(=mehrfach)-PCR”-Verfahren entwickelt, die eine parallele, also simultan im selben Reaktionsgefäß stattfindende Vervielfältigung von 16 STR-Systemen gestattet. Für die Vervielfältigung eines bestimmten Bereichs des Genoms werden immer je zwei Primer (s. PCR) benötigt, für eine 16er Multiplex-PCR bedarf es daher 32 Primer, die genau für diesen Zweck designt und aufeinander abgestimmt werden müssen.
Und es kommt noch dicker: bei 16 STR-Systemen, deren beide Allele (eins auf jedem Chromsom eines Paars) je einen von etlichen möglichen Werten aufweisen können, ist die Wahrscheinlichkeit, daß Allele von unterschiedlichen STR-Systemen gleich groß sind, sehr hoch. Zum Beispiel:

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Die Abbildung zeigt zwei DNA-Stücke, das eine gehört zu STR1, das andere aber zu STR2, die die gleiche Anzahl von Basen besitzen (s. DNA) und deshalb nicht mehr nur an ihrer Länge unterscheidbar wären.
Um solche PCR-Produkte, die von verschiedenen STR-Systemen stammen und dennoch die gleiche Länge haben, auseinanderhalten zu können, werden sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorophor) markiert und zwar immer so, daß zwei gleich lange Fragmente einen (von bis zu fünf) unterschiedlich farbigen Fluorophor tragen. Das funktioniert, indem die Fluorophore direkt an die Primer gebunden werden, die im Verlaufe der PCR ja in das entstehende Produkt eingebaut werden, so daß jedes einzelne Amplifikat eine von fünf Farben trägt. Da man vorher weiß, welche Allelwerte in welchen STR-Systemen auftreten können, kombiniert man STR-Systeme und Farben so, daß ausgeschlossen ist, daß zwei gleich lange Fragmente verschiedener STR-Systeme auch dieselbe Farbe tragen. So könnte eine solche Zuordnung aussehen:

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Am Ende einer Multiplex-PCR liegt also immer ein Gemisch vor, in dem jedem Allel aller darin vervielfältigten STR-Systeme einem DNA-Fragment mit einer einmaligen Kombination von Länge und Farbe entspricht. Die Abbildung zeigt ein Beispiel:

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Kommentare (16)

  1. #1 Stefan
    18/06/2011

    “Da bei DNA die Ladungsdichte proportional zur Länge ist, bestimmt die Länge eines DNA-Fragments, wie rasch ein solches zur Anode wandert.”
    Ist es nicht so, dass die LadungsDICHTE unabhängig von der Länge ist, nämlich zwei negative Ladungen pro Basenpaar bei doppelsträngiger DNA? Du willst doch damit sagen, dass die Anzahl der Ladungen proportional zur Länge der DNA-Fragmente ist. Oder habe ich den Begriff der Ladungsdichte falsch verstanden und er bezeichnet genau das?
    Wichtigere Frage: Der Satz oben erweckt den Eindruck, dass längere Moleküle mit mehr negativen Ladungen schneller im Polymer wandern. Ich dachte, es wäre so wie bei der Agarose-Gelelektrophorese, dass sich kürzere Fragmente nicht so sehr im Polymer “verheddern” wie große Moleküle und daher trotz einer niedrigeren Anzahl an Ladungen schneller durchlaufen…oder bin ich hier komplett aufm Holzweg?
    Gruß Stefan

  2. #2 Cornelius Courts
    20/06/2011

    @Stefan: “Du willst doch damit sagen, dass die Anzahl der Ladungen proportional zur Länge der DNA-Fragmente ist.”

    Danke für den Hinweis, die Formulierung ist tatsächlich etwas unglücklich. Die Linienladungsdichte ist definiert als “Ladung pro Längeneinheit”, d.h. umso mehr Ladung, desto länger, die Ladung nimmt also proportional zur Länge zu.
    Ist verbessert.

    “er Satz oben erweckt den Eindruck, dass längere Moleküle mit mehr negativen Ladungen schneller im Polymer wandern”
    Auch hier: guter Hinweis auf unzureichende Formulierung, danke. Natürlich ist es auch bei der Kap.El. so, daß die längeren Fragmente langsamer wandern (gerade WEIL sie im Verhältnis nicht stärker geladen sind, als kürzere). Die Formulierung, “die Länge bestimmt, wie rasch…” widerspricht dem nicht, ist aber zur Vermeidung von Mißverständnissen verbesserbar. Soeben geschehen.

  3. #3 Stefan
    20/06/2011

    @CC: alles klar, dann bin ich beruhigt, dass ich nicht komplett daneben lag :-) Übrigens: keep up the good work! Ich lese hier wirklich sehr gerne! Gruß Stefan

  4. #4 Cornelius Courts
    20/06/2011

    @Stefan: “keep up the good work! Ich lese hier wirklich sehr gerne!”
    Danke Dir! :-)

  5. #5 Katja
    13/07/2011

    Hallo,
    vorab ersteinmal vielen Dank für die tollen Artikel, die mir während meiner Arbeit wirklich weiterhelfen.
    Meine Frage:
    Was genau signalisieren denn nun die Achsen im Elektropherogramm? Die X-Achse beschreibt das Allel, die Y-Achse (die ja relative hohe Werte annimmt z.b. 5700) beschreibt die Basenlänge des STRs??? Und der obere Bereich (wie z.B. 150) gibt die Länge der Basen des Allels im STR an?
    Das habe ich sicherlich falsch verstanden. Bitte um Aufklärung.
    Vielen Dank.
    katja

  6. #6 Cornelius Courts
    14/07/2011

    @Katja: das Elektropherogramm liest sich so:
    die “X-Achse” repräsentiert die Länge eines Fragments: je weiter rechts, desto länger ist das Fragment (das siehst Du daran, daß die Allele mit den höheren Zahlen in einem System immer rechts stehen). Die kleinen Zahlen geben die Basenlänge an. Wichtig ist, zu verstehen, daß es für jede “Farbe” eine X-Achse gibt (hier 4) und daß so auch gleichgroße Fragmente (wie z.B. Allel 15 in D3S1358 und Allel 14 in D19S433) anhand der Farbe unterschieden werden können. Es kann zudem durchaus vorkommen, daß ein Allel in einem System eine höhere Zahl hat als ein Allel in einem anderen System derselben Farbe (z.B. Allel 28 in D21S11 / Allel 12 in D18S51) und trotzdem das zugehörige DNA-Fragment kleiner ist. Das liegt daran, daß die Allelbezeichnung ja nur die Anzahl der Widerholungen angibt und nichts über die absolute Fragmentlänge aussagt.

    Die “Y-Achse” gibt die Peakhöhe, also die Signalintensität an. Die Einheit sind “rfu”, sie “relativen Fluoreszenzeinheiten”. Je mehr Kopien eines Fragmentes detektiert werden, desto höher wird ein Peak. In einem “balancierten” Profil sollten die beiden Peaks eines Systems etwa gleich hoch sein, weil dann beide STR-Systeme eines Chromosomenpaares gleich gut in der PCR verfielfältigt worden sind. Im vorliegenden Profil ist das so.

    Hoffe, das hilft Dir weiter und danke für die Rückmeldung.

  7. #7 Sue-Mie
    11/01/2012

    Danke für diesen wunderbaren Blog,
    ich lese erst vor kurzem hier und muss sagen, super Sache, perfekt verständlich.
    Das hat mir wirklich sehr geholfen!
    LG

  8. #8 Cornelius Courts
    12/01/2012

    @Sue-Mie: danke für die Rückmeldung – freut mich, wenn es hilfreich war :-)

  9. #9 Maria
    15/05/2012

    Du hast geschrieben: “DNA-Fragmente sind in wässriger Lösung negativ geladen und bewegen sich in einem elektrischen Feld daher immer zum positiv geladenen Pol (Anode).” In der Abbildung sieht es aber so aus, als ob die Fragmente sich in Richtung Kathode bewegten (s. Pfeil). Wie ist das zu verstehen?

  10. #10 Cornelius Courts
    15/05/2012

    @Maria: ja, diese Unstimmigkeit erklärt sich durch die Inkonsistenz bei der Verwendung der Begriffe für die Stromrichtung:
    http://de.wikipedia.org/wiki/Technische_Stromrichtung#Elektrischer_Strom_vs._Elektronenstrom_vs._Ionenstrom

    Der PFeil würde sozusagen die technische Stromrichtung anzeigen.

  11. #11 Freschta
    12/12/2014

    Danke für den Kommentar, ich schreibe morgen eine LK- Klausur über dieses Thema und mir hat es wirklich geholfen. Ich lese den Block hier wirklich gerne. 😀

  12. #12 Cornelius Courts
    12/12/2014

    @Freschta: danke für die Rückmeldung und viel Erfolg :-)

  13. #13 Debbi Soran
    22/11/2015

    I really like your writing style, great info, regards for putting up :D. “In every affair consider what precedes and what follows, and then undertake it.” by Epictetus.

  14. #14 less and
    11/12/2015
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    24/02/2016

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    01/03/2016